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.2013年10月；33(19):3907-19.
doi:10.1128/MCB.00627-13。 Epub 2013年8月5日。

自噬对皮层神经元早期轴突生长的负调控

Byung-Kwan Ban公司 1, Mi-Hee Jun先生, Hyun-Hee Ryu先生, Deok-Jin Jang公司, S塔里克·艾哈迈德, 李进阿
附属公司

自噬对皮层神经元早期轴突生长的负调控

Byung-Kwan Ban公司等。 摩尔细胞生物学. 2013年10月.

摘要

神经突起生长需要神经突起伸展和收缩，这与蛋白质降解有关。自噬是一种保守的体降解途径，调节多种细胞过程。然而，人们对早期轴突生长过程中的自噬调节知之甚少。在这项研究中，我们研究了自噬是否参与早期轴突生长，以及它如何调节初级皮层神经元的轴突生长。自噬成分在早期神经突起生长期间表达并激活。有趣的是，atg7小干扰RNA（siRNA）抑制自噬导致轴突伸长，而雷帕霉素激活自噬抑制轴突生长。令人惊讶的是，抑制自噬降低了RhoA的蛋白水平。此外，RhoA的表达抑制了自噬抑制介导的轴突过长，而Y-27632对RhoA信号通路的抑制恢复了雷帕霉素介导的对轴突生长的抑制。有趣的是，负性调节RhoA的hnRNP-Q1在自噬缺陷的神经元中积累，而其蛋白水平因自噬激活而降低。总的来说，我们的研究表明，自噬通过RhoA-ROCK途径通过调节初级皮层神经元中的hnRNP-Q1来负向调节轴突延伸。因此，自噬可能作为一种微调机制来调节早期轴突延伸。

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数字

图1
图1
自噬相关基因在培养的皮层神经元的早期轴突生长过程中表达，自噬被激活。从DIV1到DIV5培养的皮层神经元的（A到E）Western blot（A）和条带定量图（B到E）显示ATG5、LC3-II和p62增加，磷酸化p70（pP70）S6激酶/p70 S6激酶比值降低（表明mTOR抑制），表明自噬诱导。GAPDH被用作负荷控制和量化的归一化带。磷酸化的p70-S6激酶带被归一化为p70-S5激酶带。这些值是三个独立重复的平均值（SEM）的平均值和标准误差。单向方差分析和Tukey的多重比较检验；*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001. （F） 培养的DIV2和DIV3皮层神经元在氯化铵（NH）存在下的Western blot4DIV3处的Cl）或亮氨酸肽（Leup）显示LC3和p62水平增加。（G至I）DIV2和DIV3培养皮层神经元RFP-GFP阳性自噬体的代表性图像（G）和定量图像（H），表达GFP-RFP-LC3或RFP-LC三，显示自噬小体（puncta）在细胞体（G）以及DIV3轴突（I，a）中的积聚。这些值是三个独立重复的平均值和SEM。学生的t吨测试：***，P（P）< 0.001. RFP-LC3阳性自噬体定位于Tau标记的轴突的近端（I，b）和远端（I，c）区域。箭头表示LC3阳性自噬体。标尺，20μm（G和I，a）和5μm（I，b和c）。（J） 使用培养的发育中皮层神经元（从DIV1到DIV11）对LC3进行Western blot分析。
图2
图2
自噬抑制第7天siRNA在早期轴突生长过程中导致轴突伸长。（A至C）Western blot（A）、Western blot定量（LC3-II和ATG7）（B）以及转染了第7天与转染干扰siRNA的对照组（CTL）相比，siRNA显示ATG7和LC3-II水平（a和B）以及细胞体中的自噬体（C）降低，表明自噬受到抑制。抗siRNA人共同转染挽救的神经元第7天–c-myc(第7天–c-myc*）和第7天siRNA（Rescue）在ATG7、LC3-II或自噬体中没有明显减少，表明siRNA治疗的特异性。GAPDH被用作负荷控制。（D） 从同一个神经元获得的2个或3个单独的图像生成神经突起形态的复合图像，以跟踪神经突起的总长度。（D和E）神经突起生长的代表性图像（D）和转染了第7天siRNA显示总轴突和轴突显著增加，但树突长度没有增加，而第7天–c-myc*（用c-myc抗体标记的插入物）在总轴突、轴突和树突长度方面没有显著变化。将每个siRNA与GFP共转染，以确定轴突形态。CTL，对照神经元转染干扰siRNA。数值显示为三个独立实验的平均值±SEM。单向方差分析和Tukey的多重比较检验；*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ns，不显著。比例尺，20μm。（F） 加扰siRNA（CTL）或第7天将siRNA转染培养的皮层神经元，检测发育中神经元DIV1至DIV3的轴突形态，并测定轴突尖端的数量。值显示为平均值和SEM。学生的t吨测试；ns，不显著。（G） 加扰siRNA（CTL）或第7天将siRNA转染至DIV1培养的皮层神经元。通过在转染后24小时和48小时计数存活的神经元来测量细胞活力。值显示为平均值和SEM。学生的t吨测试；ns，不显著。（H和I）培养的神经元转染GFP，以观察DIV2的细胞形态。在DIV2用3-MA（10 mM）处理细胞12 h。显示了DIV2和DIV3培养皮层神经元的神经突起生长（h）的代表性图像和神经突起长度（I）的量化图。（H） 从从同一神经元获得的2个单独的图像生成轴突形态的合成图像，以跟踪第7天siRNA转染神经元。值显示为平均值和SEM。学生的t吨测试；***，P（P）< 0.001. 比例尺，20μm。
图3
图3
雷帕霉素的自噬激活导致轴突早期生长受到抑制。（A至E）在无（A）或存在（B）氯化铵（10 mM）的情况下的蛋白质印迹（A和B）、RFP-LC3阳性自噬体的代表性图像（用箭头表示）（C）、轴突长度（D）以及用10 nM雷帕霉素（Rapa）处理的DIV1和DIV2培养皮层神经元的轴突长度量化图（E）DIV1组的LC3增加（LC3-II更健壮），磷酸化p70 S6激酶/p70 S6蛋白激酶比值（a）降低，自噬体的积累（C），DIV2组的总轴突和轴突显著减少，但树突长度（D和E）没有明显减少，这表明雷帕霉素诱导了自噬。GAPDH被用作负荷控制。转染第7天siRNA加雷帕霉素治疗后，神经突总长度和轴突长度显著改善，而第7天–c-myc*在总轴突和轴突长度方面没有改善。将每个siRNA与GFP共转染，以确定轴突形态。将打乱的siRNA转染CTL、对照神经元。数值显示为三个独立实验的平均值±SEM。单向方差分析和Tukey的多重比较检验；*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ns，不显著。比例尺，20μm。（F和G）加扰siRNA（CTL）或atg7型将siRNA转染至DIV1培养的皮层神经元。转染24小时后对神经突总长度进行量化。所示为培养的DIV1和DIV2皮层神经元的轴突生长（F）的代表性图像和轴突长度（G）的量化图。值显示为平均值和SEM。学生的t吨测试；ns，不显著。比例尺，20μm。
图4
图4
RhoA通过自噬抑制下调，在早期神经突起生长时上调。（A和B）从DIV1到DIV5的培养的皮层神经元的条带（B）的蛋白质印迹（A）和定量图，显示RhoA水平增加。GAPDH被用作负荷控制和量化的归一化带。这些值是三个独立重复的平均值和SEM。单向方差分析和Tukey的多重比较检验；*，P（P）< 0.05. 与DMSO（载体）处理的对照组（CTL）相比，经10mM 3-MA处理的DIV2和DIV3培养皮层神经元的（C和D）Western blot（C）和条带（D）量化图显示RhoA和LC3-II水平显著降低，表明抑制自噬下调RhoA。GAPDH被用作负荷控制。这些值是三个独立重复的平均值和SEM。单向方差分析和Tukey的多重比较检验；*，P（P）< 0.05. （E和F）Western blot（E）和DIV2和DIV3转染的培养皮层神经元条带（F）的量化图第7天siRNA显示RhoA、ATG7和LC3-II相对于那些转染干扰siRNA（CTL）的siRNA显著降低，表明抑制自噬下调RhoA。GAPDH被用作负荷控制。这些值是来自三个独立重复的归一化带强度的平均值和SEM。学生的t吨测试；**，P（P）< 0.01. （G和H）Western blot（G）和第5天−/−与野生型MEF（WT）相比，MEF显示RhoA和LC3-II水平显著降低，表明抑制自噬下调RhoA。GAPDH被用作负荷控制。这些值是三个独立重复的平均值和SEM。学生的t吨测试；**，P（P）< 0.01.
图5
图5
RhoA公司重量或RhoAG14伏拯救自噬抑制引起的异常轴突延伸。（A和B）培养的DIV1至DIV3皮层神经元的轴突生长代表性图像（A）和轴突长度量化图（B）第7天与干扰siRNA转染相比，siRNA在总轴突和轴突长度方面显著增加，但在树突长度方面没有显著增加第7天野生型siRNA（Flag-RhoA重量[WT]）或组成型活性（Flag RhoAG14伏[G14V]）RhoA。RhoA显著恢复了轴突过度伸展表型，表明RhoA的异位表达恢复了自噬介导的RhoA减少缺陷。用Flag-RhoA转染重量单独没有表现出神经炎表型；然而，用组成活性RhoA转染G14伏与对照组相比，单独用药组神经突起长度显著缩短。将每个siRNA与GFP共转染，以确定轴突形态。CTL，对照神经元转染干扰siRNA。数值显示为三个独立复制的平均值±SEM。单向方差分析和Tukey的多重比较检验；***，P（P）< 0.001; ns，不显著。比例尺，20μm。
图6
图6
Y-27632对ROCK的抑制恢复了雷帕霉素对轴突生长的抑制。（A和B）用10 nM雷帕霉素处理的DIV2培养皮层神经元的轴突生长代表性图像（A）和轴突长度量化图（B）显示，与载体（DMSO）处理相比，总轴突和轴突的长度显著减少，但树突的长度没有减少。用10 nM雷帕霉素和50μM Y-27632（一种ROCK抑制剂）联合治疗，显著挽救了雷帕霉素表型，表明抑制ROCK通路可以缓解由于雷帕霉素介导的自噬激活而导致的轴突长度缩短。单独使用Y-27632治疗后，突起表型没有任何显著变化。将每个siRNA与GFP共转染，以确定轴突形态。CTL，DMSO处理的对照神经元。数值显示为三个独立重复的平均值±SEM。单向方差分析和Tukey的多重比较检验；***，P（P）< 0.001; ns，不显著。比例尺，20μm。（C） 在DIV1用雷帕霉素（10 mM）或Y-27632（50μm）或两者处理皮层神经元14至16 h。在DIV2用雷帕霉素处理的神经元中测定轴突尖端的数量。数值显示为平均值和SEM。单向方差分析和Tukey多重比较检验；**，P（P）< 0.01; ns，不显著。（D） 在DIV2和DIV3处用50μM Y-27632处理转染GFP的皮层神经元。对轴突总长度进行了量化，发现轴突长度显著增加。这些值是三个独立重复的平均值和SEM。单向方差分析和Tukey的多重比较检验；***，P（P）< 0.001.
图7
图7
hnRNP-Q1的蛋白水平，而非其mRNA水平，在早期神经突起生长期间由自噬调节。（A和B）Western blot（A）和第5天−/−MEFs显示hnRNP-Q1水平增加，表明自噬对hnRNP-Q1产生负调控。GAPDH被用作负荷控制和量化的归一化带。这些值是三个独立重复的平均值和SEM。学生的t吨测试；*，P（P）< 0.05. （C） 使用野生型或第5天−/−MEF公司。GAPDH被用作负载控制。（D） 野生型和第5天−/−MEF公司。这些值是三个独立重复的平均值和SEM。ns，不显著。（E和F）Western blot（E）和第5天−/−转染hnRNP-Q1 siRNA的MEF显示，相对于对照加扰siRNA，hnRNP-Q 1水平（F）显著降低，RhoA水平（F。GAPDH被用作负荷控制。这些值是三个独立重复的平均值和SEM。学生的t吨测试；**，P（P）< 0.01. （G） 培养的DIV2和DIV3皮层神经元的Western blot显示，与DIV2相比，DIV3的hnRNP-Q1显著减少，LC3-II增加，表明自噬激活与早期神经突起发育期间hnRNP-Q的减少一致。GAPDH被用作负荷控制。（H） 氯化铵（NH）处理DIV2和DIV3培养皮层神经元的Western blot4与溶酶体对照（CTL）相比，Cl）和leupeptin（Leupepin）阻止溶酶体降解显示hnRNP-Q1和LC3-II水平增加。（一） 经雷帕霉素（Rapa）处理的DIV2和DIV3培养皮层神经元的Western blot显示，在NH存在或不存在的情况下，hnRNP-Q1减少，LC3-II增加4Cl.GAPDH用作加载控制。（J和K）半定量RT-PCR（J）和谱带强度密度定量（K）的代表性凝胶图像，显示用10 nM雷帕霉素或二甲基亚砜（CTL）处理或转染第7天siRNA或加扰siRNA（CTL）。CTL（DMSO或干扰siRNA）和自噬调节的神经元之间hnRNP-Q1的mRNA水平没有显著差异。hnRNP-Q1 mRNA的相对基因表达归一化为GAPDH。这些值是三个独立重复的平均值和SEM。学生的t吨测试；ns，不显著。（L和M）半定量RT-PCR（L）和带强度密度定量（M）的代表性凝胶图像，说明野生型和野生型中hnRNP-Q1 mRNA的相对水平第5天−/−MEF公司。野生型和野生型之间hnRNP-Q1的mRNA水平没有显著差异第5天−/−MEF公司。hnRNP-Q1 mRNA的相对基因表达归一化为GAPDH。这些值是三个独立重复的平均值和SEM。学生的t吨测试；ns，不显著。
图8
图8
自噬调节的hnRNP-Q1负性调节RhoA并影响培养神经元的早期轴突生长。与对照组相比，转染hnRNP-Q1 siRNA的DIV1至DIV3培养皮层神经元的（A和B）Western blot（A）和条带定量图（B）显示hnRNP-Q 1水平（B）显著降低，RhoA水平（B，表明hnRNP-Q1对皮层神经元的RhoA具有负调节作用。GAPDH被用作负荷控制和量化的归一化带。这些值是三个独立重复的平均值和SEM。学生的t吨测试；**，P（P）< 0.01. DIV2和DIV3培养皮层神经元的（C和D）Western blot（C）和条带（D）量化图第7天和hnRNP-Q1 siRNA显示自噬缺陷介导的RhoA水平降低的恢复。GAPDH被用作负荷控制。这些值是三个独立重复的平均值和SEM。单向方差分析和Tukey的多重比较检验；**，P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001. （E和F）神经突起形态的合成图像（E）由从同一神经元获得的2或3个单独图像生成，以跟踪神经突起的总长度第7天siRNA转染神经元。神经突起生长的代表性图像（E）和培养的DIV1至DIV3皮层神经元神经突起长度（F）的量化图第7天siRNA、hnRNP-Q1 siRNA或两者都表明第7天siRNA（pSICOR-RFP中）与hnRNP-Q1 siRNA（在pSUPER-GFP中）显著恢复轴突过度伸展表型，表明hnRNP-Q的减少可恢复RhoA水平并抑制异常轴突伸长。与对照组相比，仅转染hnRNP-Q1 siRNA的突起长度略有减少。使用hnRNP-Q1或第7天siRNA和神经突起形态分别通过GFP或RFP的表达或两者的表达来确定。CTL，对照神经元转染干扰siRNA。数值显示为三个独立复制的平均值和SEM。单向方差分析和Tukey的多重比较检验；*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001; ns，不显著。比例尺，20μm。
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