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.2013年7月22日；8（7）：e70599。
doi:10.1371/journal.pone.0070599。 2013年印刷。

Vismodegib抑制TRAIL介导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型肝损伤

佩特拉·赫索娃 1, 萨马尔·易卜拉欣, 史蒂芬·F·布朗克, Hideo Yagita公司, 格雷戈里·戈尔斯
附属公司

Vismodegib抑制TRAIL介导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型肝损伤

佩特拉·希尔索娃等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

刺猬信号通路激活与NASH的发病机制有关。尽管有这个概念，刺猬途径抑制剂尚未被探索。因此，我们在饮食诱导的NASH模型中检测了刺猬信号通路抑制剂vismodegib的作用。将C57BL/6小鼠置于3个月的食物或FFC（高饱和脂肪、果糖和胆固醇）饮食中。在处死前一周，用vismodegib或载体对小鼠进行治疗。喂食FFC饮食的小鼠出现了明显的脂肪变性，而vismodegib治疗没有改变。相反，vismodegib显著减轻FFC诱导的肝损伤，表现为血清ALT和肝TUNEL阳性细胞减少。与凋亡减少一致，vismodegib阻止了FFC诱导的死亡受体DR5及其配体TRAIL的强烈上调。此外，在使用DR5激动剂治疗后，喂食FFC的小鼠（而非喂食食物的动物）发生了显著的肝损伤和凋亡；然而，这种损伤是通过使用vismodegib进行预处理来预防的。vismodegib使FFC诱导的炎症标记物正常化，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、单核细胞趋化蛋白-1和各种巨噬细胞标记物的mRNA，这与肝损伤减少一致。此外，喂食FFC小鼠的vismodegib消除了肝纤维化指数。总之，在营养过剩的NASH模型中，用vismodegib抑制刺猬信号传导似乎可以减少TRAIL介导的肝损伤，从而减轻肝脏炎症和纤维化。我们推测刺猬信号抑制可能对人类NASH有益。

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竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。刺猬信号通路在NASH的营养过剩模型中被激活。
C57BL/6小鼠喂食食物或FFC饮食3个月。然后用vismodegib（25毫克/千克体重）或载体对小鼠进行额外一周的处死前处理。按照材料和方法中的描述获取和处理肝组织。（A） 用免疫组织化学方法检测石蜡包埋肝组织中声波刺猬的表达，并显示40倍物镜下的典型显微照片。（B） 从肝组织中提取总RNA，并通过实时PCR定量patched 1的基因表达。（C） 从喂食食物和FFC饮食的小鼠中分离肝细胞。提取总RNA，通过实时PCR评估平滑和Gli1的基因表达。（D） 从喂食食物和FFC饮食的小鼠中分离肝细胞。用western blotting检测平滑蛋白的表达。条形柱代表平均值±S.E.M*P（P）<0.05.
图2
图2。FFC饮食导致严重脂肪变性。
按照图1所示对小鼠进行治疗。（A） 固定肝标本用H&E染色。（B）无标签冷冻肝组织切片用CARS显微镜成像，以25倍物镜观察脂肪变性。（C） 测量肝组织中中性甘油三酯的浓度，并将其归一化为蛋白质浓度。（D-F）从肝组织中提取总RNA，通过实时PCR定量脂肪生成酶（D）、脂肪分解酶（E）和参与甘油三酯合成和分泌的酶（F）的基因表达。数值表示为平均值±S.E.M***P（P）<0.001, **P（P）<0.05, *P（P）<0.01.
图3
图3。内脏模型治疗的FFC饮食喂养小鼠的肝损伤减轻。
（A） 用标准技术测量图1中处理的小鼠样品的血清ALT值。（B） 用TUNEL法检测冷冻肝组织标本中肝细胞的凋亡。通过荧光显微镜在20个随机显微镜场（20×）中计数TUNEL阳性细胞核来量化凋亡细胞。数据代表平均值±S.E.M***P（P）<0.001, *P（P）<0.01.
图4
图4。Vismodegib可消除FFC饮食诱导的死亡受体DR5上调，并防止FFC饮食小鼠中DR5介导的肝损伤。
（A，B）给小鼠喂食食物或FFC饮食3个月。然后，在处死小鼠之前，用vismodegib或载体再治疗一周。从肝组织中提取总RNA，并通过实时PCR定量死亡受体（A）和死亡受体配体（B）的表达。（C，D）将一组小鼠用chow或FFC饮食喂养3个月，然后用vismodegib或载体治疗2周。在献祭前的最后一周内，对vismodegib和车辆治疗组的每种饮食进行了两次MD5-1（一种激动性抗DR5抗体）注射。分析各组血清ALT值（C）和肝脏TUNEL阳性细胞（D）。（E） Huh-7细胞用vismodegib（0–1µM）预处理16 h，然后用600µM棕榈酸（PA）再处理8 h。提取总RNA，并通过实时PCR评估DR5的表达。Huh-7细胞中DR5的表达表示为四个独立实验的平均值。数据表示平均值±标准误差***P（P）<0.001, **P（P）<0.05, *P（P）<0.01.
图5
图5。使用FFC饮食的vismodegib处理小鼠的巨噬细胞积聚和活化减少。
（A） 从按图1所述处理的小鼠肝组织中提取总RNA，并通过实时PCR评估几个巨噬细胞标记物的表达谱。（B） 另一种巨噬细胞标记物Mac-2在石蜡包埋的肝组织上通过免疫组化进行了检测，并显示了20倍物镜下的典型显微照片。如右图所示，通过对每个肝组织切片中十个随机区域的Mac-2阳性区域进行形态计量分析来评估巨噬细胞的聚集。（C） 通过实时PCR分析每个实验组获得的肝组织中与巨噬细胞激活相关的细胞因子IL-1β、IL-6和MCP-1的基因表达。（D） 从喂食食物和用载体或vismodegib处理的FFC饮食的小鼠中分离出肝巨噬细胞。提取总RNA，通过实时PCR评估刺猬信号靶基因的基因表达。条形柱代表平均值±S.E.M***P（P）<0.001, **P（P）<0.05, *P（P）<0.01.
图6
图6。Vismodegib可减轻FFC饮食诱导的肝纤维化。
（A） 从按照图1所述处理的小鼠的肝组织中提取总RNA，并通过实时PCR评估促纤维化标记物的表达谱。（B） 固定肝组织切片用天狼星红染色以检测胶原沉积。然后，如右图所示，通过形态计量学评估天狼星红染色的数字图像（用20倍物镜拍摄）。（C） 使用25倍物镜，通过SHG显微镜对无标签冷冻肝组织切片进行成像，以可视化胶原沉积。然后使用自动化软件将胶原区域量化为强度高于阈值的SHG信号区域。条形柱表示平均值±S.E.M***P（P）<0.001, **P（P）<0.05, *P（P）<0.01.
图7
图7。NASH中vismodegib治疗的机械示意图。
NASH期间的脂毒性诱导TRAIL:DR5介导的肝细胞损伤和凋亡。受损的肝细胞分泌化学吸引物，如MCP-1或声波刺猬，吸引并招募单核细胞。浸润肝脏的单核细胞/巨噬细胞被激活并促进炎症反应，进而导致肝细胞损伤。Vismodegib通过抑制DR5的上调，从而阻断TRAIL:DR5介导的细胞凋亡和相关的肝损伤，以及随后的单核细胞/巨噬细胞向肝脏的募集，从而打破这个循环。
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