Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons

doi:10.1007/s00401-013-1149-y

.2013年9月；126(3):385-99.

doi:10.1007/s00401-013-1149-y。 Epub 2013年7月9日。

用iPSC-derived人类神经元C9ORF72重复扩增模拟额颞叶痴呆的主要病理特征

桑德拉·阿尔梅达¹, 爱德华多·加斯肯, Hélène Tran公司, 辛俊周, 塔尼亚·F·根德隆, 史蒂文·德古特, 安德鲁·R·塔珀, Chantal Sellier公司, 尼古拉斯·查利特·贝盖兰（Nicolas Charlet-Berguerand）, 安娜·卡里达斯, 威廉·西利, 亚当·巴克瑟, 伦纳德·彼得鲁切利, 布鲁斯·米勒, 汾标高

附属公司

PMID： 23836290
预防性维修识别码：项目经理3753484
内政部： 10.1007/s00401-013-1149年

在iPSC衍生的人类神经元中用C9ORF72重复扩增模拟额颞叶痴呆的关键病理特征

桑德拉·阿尔梅达等。神经病理学学报. 2013年9月.

.2013年9月；126(3):385-99.

doi:10.1007/s00401-013-1149-y。 Epub 2013年7月9日。

作者

桑德拉·阿尔梅达¹, 爱德华多·加斯肯, Hélène Tran公司, 辛俊周, 塔尼亚·F·根德隆, 史蒂文·德古特, 安德鲁·R·塔珀, Chantal Sellier公司, 尼古拉斯·沙勒·贝吉兰, 安娜·卡里达斯, 威廉·西利, 亚当·巴克瑟, 伦纳德·彼得鲁切利, 布鲁斯·米勒, 汾标高

附属

¹马萨诸塞大学医学院神经病学系，美国马萨诸塞州伍斯特市，邮编01605。

PMID： 23836290
预防性维修识别码：项目经理3753484
内政部： 10.1007/s00401-013-1149年

勘误表in

神经病理学学报。2014年6月；127(6):941

摘要

最近发现的C9ORF72非编码区GGGGCC重复序列扩增是额颞叶痴呆（FTD）或肌萎缩侧索硬化（ALS）患者最常见的致病性突变。我们建立了一个人类神经元模型，并研究了含有GGGCC重复扩增的人类神经元的病理表型。对C9ORF72中GGGGCC重复序列大于1000的两名受试者进行皮肤活检，并使用其各自的成纤维细胞生成多诱导多能干细胞（iPSC）系。在广泛鉴定后，从每个受试者中选择两个iPSC系，将其分化为有丝分裂后神经元，并与对照神经元进行比较，以确定与疾病相关的表型。扩增的GGGGCC重复序列在iPSC的重编程和神经元分化过程中表现出不稳定性。在一些iPSCs、iPSC-derived人类神经元和原代成纤维细胞中存在含有GGGGCC重复序列的RNA焦点。有病灶的细胞百分比和每个细胞的病灶数似乎不仅取决于重复长度，还取决于其他因素。这些RNA焦点似乎并没有隔离几个主要的RNA结合蛋白。此外，在GGGCC重复扩增的人类神经元中检测到重复相关的非ATG（RAN）翻译产物，这些神经元的p62水平显著升高，并且对自噬抑制剂诱导的细胞应激的敏感性增加。我们的研究结果表明，具有GGGCC重复扩增的FTD/ALS的主要神经病理学特征可以在iPSC衍生的人类神经元中重现，并且还表明自噬功能受损可能代表一种新的潜在致病机制。

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数字

图1
基于载流子的iPSC线的产生和表征*C9ORF72型*扩展重复。通过qRT-PCR评估来自载体1和载体2的iPSC系中重编程因子KLF4、CMYC、SOX2和OCT4的总和内源性（Endo）mRNA水平相对于人类胚胎干细胞系H9的值。数值为平均值±SEM(一). 在mRNA水平上测量多能性标记NANOG和TDGF1（或CRIPTO）的表达。H9细胞的值设置为1。数值为平均值±SEM(b条). 对来自携带者1和2的iPSC株中的多能性标记NANOG和SSEA4进行免疫荧光分析，并用Hoechst对细胞核进行复染(蓝色).比例尺50微米(**c（c）**). 在体外将iPSC系自发分化为三个胚胎胚层的细胞后，用α-胎蛋白（AFP，内胚层）、结蛋白（中胚层），βIII-管蛋白（外胚层）和Hoechst（细胞核）对细胞进行免疫染色。*比例尺*50微米(d日). 所有iPSC系均保持正常核型(电子)

图2
Southern印迹分析*C9ORF72型*成纤维细胞和两个iPSC系（第24代）中的等位基因来自每个个体。此处显示了一个代表性斑点

图3
GGGGCC重复序列不影响iPSC的神经元分化。MAP-2阳性神经元在神经元分化后有或无GGGCC重复扩增，使用Almeida等人[3]中描述的方法。核染色如所示蓝色.比例尺50微米(一). MAP-2阳性神经元百分比(b条)和GFAP阳性星形胶质细胞(**c（c）**)显示了2周龄的培养物。VGLUT1阳性细胞(d日)、GABA(电子)和TH(**（f）**)（分别为谷氨酸能、GABA能和多巴胺能标记物）计算为MAP-2的百分比⁺细胞。每个实验平均分析200个细胞(n个=3种独立文化）。数值为平均值±SEM。显示了基线时和涂抹河豚毒素（0.5μM）2分钟后神经元的典型去极化诱发动作电位。在100pA的步骤中，通过从+400到0pA的电流注入引发动作电位(n个=每条线10–14）(克). 基线检查时和应用CNQX（10μM）2分钟后的典型自发EPSCs。神经元在电压灯下保持在−60 mV(n个=每行10–11）(小时)

图4
GGGGCC在多能干细胞的神经元分化过程中重复不稳定性。iPSC对照品系20的Southern blot分析(一)，托架1的第6行(b条)，和托架2的第11行(**c（c）**)在不同的传代及其分化的神经元上。这个星号指出突变体*C9ORF72型*神经元中的等位基因。一个对照受试者和两个受试者的大脑*C9ORF72型*重复扩展载体显示不同长度的重复(d日)

图5
C9ORF72重复扩增在多能干细胞中形成RNA焦点。的表达式级别*C9ORF72型*变体1（NM_145005.5，亚型b）(一)，变体2（NM_018325.3，亚型a）(b条)和变体3（NM_001256054.1，同种型a）(**c（c）**)用qRT-PCR对来自两个非携带者和两个扩大重复携带者的iPSC株进行了评估。在对照iPSC株系20上进行荧光原位杂交（FISH）分析(d日)，托架1线路6 iPSC(电子)，托架2线路11 iPSC(**（f）**)使用cy3-共轭（GGCCCC）₄探查。RNA焦点(红色)在原子核中被发现(蓝色)载流子1和2的数量，但不在对照细胞中。固定后用核糖核酸酶A治疗多能干细胞导致病灶丢失(小时)，表明病灶确实由RNA构成。来自载体1（第5行）未经处理的iPSC的代表性图像(克)或用核糖核酸酶A治疗(小时)在室温下保持20分钟。红色含有GGGGCC重复序列的RNA病灶；蓝色细胞核（DAPI）。当Cy3-共轭（CAGG）时，细胞没有显示病灶₆探针用作阴性对照探针(我).比例尺10微米。iPSC显示焦点百分比的量化(j个)以及每个细胞的平均焦点数(k个)显示为平均值±SEM

图6
*C9ORF72型*在患者iPSCs衍生的神经元中，重复扩增形成RNA病灶。的表达式级别*C9ORF72型*变体1（NM_145005.5，亚型b）(一)，变体2（NM_018325.3，同种型a）(b条)和变体3（NM_001256054.1，亚型a）(**c（c）**)用qRT-PCR对来自两个非载体和两个扩增重复载体的iPSC-derived神经元进行评估。数值为平均值±SEM***第页<0.001（学生的t吨测试）。对对照iPSC-derived神经元进行FISH分析(d日)，载体1线路6 iPSC-衍生神经元(电子)，载体2线路11 iPSC-衍生神经元(**（f）**)使用cy3-共轭（GGCCCC）₄探查。绿色地图2。蓝色DAPI公司。*比例尺*10微米。神经元显示病灶百分比的量化(克)以及每个细胞的平均焦点数(小时)根据对来自三个独立分化实验的神经元的分析，显示为平均值±SEM。通过斑点杂交分析在载体1（iPSC株5和6）和载体2（iPSC系1和11）的神经元中检测到Gly-Pro二肽重复序列(我)

图7
GGGGCC重复扩增加剧了自噬途径抑制的敏感性。氯喹暴露后人类神经元的细胞活力(一)和3-甲基腺嘌呤（3-MA）(b条)持续24小时。数值表示为未处理细胞的百分比（对照）(n个=3种独立文化）(**a、 b条**). 暴露于5 mM 3-MA 24小时后的Caspase-3样活性(**c（c）**). 在所有面板中，数值均为平均值±SEM*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页<0.001（单向方差分析）。代表性Western blot显示两个非携带者（PGRN S116X：第1和26行，对照：第17和20行）和两个重复扩增携带者的神经元中p62蛋白水平（携带者1：第5和6行，携带者2：第1行和11行）(d日)

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