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.2013年7月；33(13):2574-85.
doi:10.1128/MCB.01677-12。 Epub 2013年4月22日。

p90 RSK2通过转录依赖和独立机制介导抗噪声信号

金灵涛 1, 李丹, 李钟硕, 香农精灵, 吉娜·N·阿莱西, 范军（Jun Fan）, 喜邦康, 王东生, 海安福, 杰克·汤顿, 提图斯·J·博根, 梅根·塔克, 丁磊谷, 卓国晨, 董敏欣, 法德洛·R·库里, 苏敏康
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p90 RSK2通过转录依赖和独立机制介导抗噪声信号

金灵涛等。 分子细胞生物学. 2013年7月.

摘要

侵袭性和转移性肿瘤细胞如何逃避失巢诱导尚不清楚。我们发现，敲低RSK2可使多种癌细胞对失巢凋亡诱导敏感，失巢凋亡是通过磷酸化靶点介导的，包括凋亡信号调节激酶1（ASK1）和环腺苷酸（cAMP）反应元件结合蛋白（CREB）。我们提供证据表明，RSK2通过磷酸化S83、T1109和T1326来抑制ASK1，其机制是磷酸化-T1109/T1326抑制ATP与ASK1的结合，而磷酸化-S83减弱ASK1底物MKK6的结合。此外，RSK2→CREB信号通路通过调节参与细胞死亡调节的蛋白效应器的基因表达，包括抗凋亡因子蛋白酪氨酸激酶6（PTK6）和促凋亡因子生长抑制蛋白3（ING3），提供抗噪声保护。PTK6过度表达或ING3敲除以及ASK1敲除进一步挽救了RSK2敲除细胞对失巢诱导敏感性的增加。这些数据共同表明，RSK2作为一个信号整合子，以转录依赖和依赖的方式向癌细胞提供抗噪声保护，部分通过ASK1和CREB发出信号，并促进癌细胞侵袭和肿瘤转移。

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数字

图1
图1
RSK2的缺失使多种癌细胞对失巢凋亡诱导敏感。（A） 与携带空载体的对照细胞相比，shRNA对RSK2的稳定敲除不影响对照剂环己酰亚胺（CHX）诱导的细胞凋亡。（B） 与含有空载体或含有靶向eGFP的shRNA载体的对照细胞相比，两个不同shRNA克隆对RSK2的稳定敲除可使转移性HNSCC 212LN（左）、乳腺癌SKBR3（中）和肺癌A549（右）细胞敏化为分离诱导的失巢凋亡。细胞培养在1%琼脂处理的培养皿上以实现分离，对照细胞用抗癌剂环己酰亚胺（蛋白质生物合成抑制剂）处理以诱导凋亡。通过FACS分析FITC-结合膜联蛋白V和碘化丙啶（顶部）染色的细胞，或使用caspase-Glo 3/7分析（底部）通过caspase 3/7活性评估细胞凋亡。（C） 小鼠RSK2（顶部）或shRNA-resistant人类RSK2的过度表达（底部）挽救了RSK2击倒诱导的失巢凋亡，并赋予细胞抗失巢凋亡的能力。在失巢诱导之前，用小鼠RSK2 Y707A cDNA或抗shRNA-人RSK2 Y707A基因瞬时转染稳定的RSK2敲除细胞。（D） 用小分子RSK抑制剂、fmk（10μM）（顶部）或SL0101（100μM）（底部）有效降低RSK2激酶活性，并使212LN、SKBR3和A549细胞敏化以诱导失巢凋亡。对于fmk治疗，RSK2活性通过RSK2免疫沉淀（IP）和Western blotting（WB）进行评估，使用识别磷酸-S380（S386表示RSK2编号）的特定磷酸-RSK抗体。针对SL0101评估RSK2底物GSK3α/β的磷酸化。P（P）值由Student的t吨测试。图中所示的所有误差条表示三个独立实验的平均值±标准偏差（*，0.01<P（P）< 0.05; ∗∗,P（P）< 0.01; ns，不显著）。
图2
图2
RSK2抑制ASK1以保护转移癌细胞免受脱落诱导的失巢凋亡。（A） 磷酸抗体微阵列分析确定了RSK2的新磷酸化靶点，当RSK2被shRNA稳定敲除时，其磷酸化状态在HNSCC细胞中降低。测定了磷酸化蛋白的信号强度和总蛋白水平。每种蛋白质的比率被确定为HNSCC-pLKO.1-RSK2 shRNA和HNSCC-pLKO.1细胞中磷酸化蛋白质在总蛋白质中的百分比之比。在RSK2敲除的转移性HNSCC中，磷酸化状态的抗凋亡或促凋亡蛋白因子减少或增加超过15%。与对照细胞相比，抑制ASK1的S83磷酸化在886LN细胞中降低了31%，RSK2被稳定击倒。（B和C）敲低或过度表达促凋亡ASK1导致212LN细胞对失巢凋亡诱导的敏感性降低（B）或增加（C）。（D） RNAi介导的ASK1敲低减弱了212LN（左）和SKBR3（右）细胞对失巢凋亡诱导增加的敏感性，RSK2稳定敲低。（E） 特异性RSK抑制剂fmk（6μM）对RSK2的抑制导致212LN细胞对失巢凋亡诱导的敏感性增加，而ASK1的敲除可挽救fmk治疗的细胞的表型。（F） 组成活性形式RSK2（Y707A突变体）的过度表达导致ASK1激酶活性降低。GST标记的ASK1在293T细胞中与RSK2 Y707A突变体共表达或不表达。GST-ASK1被GST珠拉下，用于在体外使用重组、非活性人类MKK6蛋白作为外源底物进行ASK1激酶检测。ASK1活性通过特定磷酸化-Ser/Thr抗体检测到的MKK6磷酸化水平进行评估。（G） Western blot结果显示，组成活性形式的RSK2（Y707A突变体）的表达导致212LN细胞中p38（左）和JNK（右）的激活水平降低。分别通过识别磷酸化p38和磷酸化SAPK/JNK的特异性抗体评估p38和JNK激活。（H） RSK2的稳定敲除导致212LN细胞中p38和JNK的磷酸化和激活水平增加。
图3
图3
RSK2通过磷酸化S83抑制ASK1。（A） 敲除RSK2导致212LN细胞中ASK1磷酸化-S83水平降低。通过特异性磷酸化-ASK1抗体（p-S83）评估磷酸化-S83水平。（B） 强化RSK2表达导致S83磷酸化水平增加，但ASK1的S967或T845磷酸化水平没有增加。用HA标记的组成活性RSK2 Y707A突变体瞬时转染293T细胞。内源性ASK1的S83、S967和T845磷酸化水平是通过使用识别单个磷酸化位点的特异性磷酸化-ASK1抗体来测定的。（C） RSK2在S83直接磷酸化ASK1，但在S967或T845不磷酸化。安在体外使用重组活性RSK2（rRSK2）与WT重组ASK1（rASK1）或从大肠杆菌纯化的激酶缺失突变形式K709M孵育，进行RSK2激酶分析。（D） RSK2在S83直接磷酸化WT ASK1，但不能磷酸化S83A突变体。纯化的重组WT ASK1和S83A突变蛋白用于在体外RSK2激酶测定。（E） 安在体外使用GST标记的ASK1 K709M突变体进行RSK2激酶分析，该突变体通过GST下拉富集293T细胞。
图4
图4
T1109和T1326被鉴定为新的RSK2磷酸化位点，当磷酸化时，抑制ASK1。（A） 含有T1109和T1326的ASK1的磷酸苏氨酸肽片段的质谱光谱。从293T细胞纯化的GST-ASK1 K709M蛋白与重组活性RSK2孵育。摘除SDS-PAGE凝胶条带并用于LC-MS/MS。（B和C）T1109、T1326或S83的替换并不影响ASK1激酶活性的RSK2依赖性衰减（B），而T1109A/T1326A双突变体对RSK2依存性抑制（C）表现出抗性。在293T细胞中存在或不存在组成活性形式的RSK2（Y707A突变体）时，不同GST标记的ASK1变异体共存。在转染后24小时，收集细胞，并用GST珠拉下GST-ASK1蛋白。安在体外以髓磷脂碱性蛋白为底物进行ASK1激酶检测。（D） ASK1 T1109D/T1326D突变以显性阴性形式表达，导致RSK2敲除细胞中WT ASK1的促凋亡活性低于WT ASK1。用ASK1变异体瞬时转染RSK2敲除细胞。在转染后48小时进行失巢分析。
图5
图5
T1109/T1326和S83处的磷酸化分别通过减弱ATP和底物结合抑制ASK1。（A，左）替换T1109/T1326，而不是S83，逆转了在RSK2 CA（组成活性Y707A突变形式）存在下与ASK1的ATP结合减少。在有或无RSK2 CA的情况下表达的GST-ASK1变体通过GST下拉从293T细胞裂解物中富集，然后用[α-32P] ATP。未绑定[α-32P] ATP被冲走，并结合[α-32P] 用闪烁计数器测量ASK1上的ATP。（右）Western blot结果显示293T细胞中GST-ASK1和RSK2的表达水平。（B） 在S83而不是T1109/T1326突变，导致在RSK2 CA存在的情况下MKK6与ASK1的结合增加。GST-ASK1变异体从与RSK2 CA共存或不存在的细胞中被拉下。免疫印迹检测到结合的内源性MK6。（左）代表性免疫印迹结果。（右）来自三个不同实验的MKK6谱带的相对强度，归一化为没有RSK2表达的对照样品的值。
图6
图6
RSK2通过CREB信号转导上调抗凋亡因子PTK6和下调促凋亡因子ING3，保护细胞免受失巢凋亡诱导。（A） DNA微阵列分析确定RSK2→CREB信号通路的新转录靶点。（上图）显示与携带空慢病毒载体的对照细胞相比，来自具有RSK2 shRNA和CREB shRNA个体表达的212LN细胞的下调（115个基因）（左）或上调（45个基因）（右）的重叠转录靶点的图。（中）在RSK2和CREB击倒细胞中下调的代表性新RSK2→CREB转录靶点，包括抗凋亡因子PTK6、PINK1和MSLN。（下图）在RSK2和CREB敲除细胞中上调的代表性新RSK2→CREB转录靶点，包括促凋亡因子ING3、CKAP2和TFAP2A。与含有空载体的对照细胞相比，RSK2和CREB敲除细胞的mRNA水平变化（折叠）显示在中间和底部面板的底部行。（B） 实时逆转录-PCR结果显示，与空载体对照细胞相比，RSK2或CREB稳定敲除的212LN细胞中抗凋亡因子PTK6（左）的mRNA水平降低，促凋亡因子ING3（右）的mRNA水平升高。（C） Western blot结果显示，在RSK2（顶部）或CREB（底部）稳定敲除的212LN细胞中，PTK6和ING3的蛋白水平分别降低和升高。（D） 实时逆转录-PCR结果显示，在用增加浓度的RSK抑制剂fmk处理24小时的212LN细胞中，PTK6（左）和ING3（右）的mRNA水平分别降低和增加结果增加了癌细胞对anoikis诱导的敏感性。（F） 在稳定敲除RSK2的212LN和SKBR3细胞中，Flag-tagged PTK6的表达显著减弱了对失巢凋亡诱导增加的敏感性。（G） 在RSK2基因敲除的212LN和SKBR3细胞中，ING3基因敲除导致对失巢凋亡诱导增加的敏感性显著减弱。annexin V染色评估凋亡细胞死亡。
图7
图7
RSK2通过ASK1和CREB转录靶点介导抗噪声信号。（A和B）敲除RSK2导致对失巢凋亡诱导的敏感性增加，敲除ASK1可显著挽救该表型，而同时敲除ASK1和过度表达PTK6（A）或敲除ING3（B）可进一步起到挽救作用。将稳定的RSK2敲低细胞与ASK1 siRNA和Flag-PTK6或ING3 siRNA瞬时共转染24小时，然后转移到琼脂处理的平板上并培养48小时。通过膜联蛋白V染色评估凋亡细胞死亡。（C） 转移癌细胞中RSK2介导抗噪声信号传导的拟议模型。RSK2是转移细胞中的信号整合子，以急性和慢性方式磷酸化和调节多种蛋白因子，以提供抗噪声信号。
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