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.2013年6月1日；9(6):850-60.
doi:10.4161/auto.24083。 Epub 2013年4月10日。

谷氨酸脱氢酶在调节自噬中有助于亮氨酸传感

塞维琳·洛林 1, 马克·托尔, 香塔尔·鲍维, 安内克罢工, 克里斯蒂安·波依斯, 亚瑟·J·维尔霍文, 帕特里斯·科多诺, 阿尔弗雷德·梅耶尔
附属公司

谷氨酸脱氢酶在调节自噬中有助于亮氨酸传感

塞维琳·洛林等。 自噬. .

摘要

众所周知，氨基酸，尤其是亮氨酸，可以抑制自噬，至少部分是因为它们能够刺激MTOR介导的信号传导。有证据表明，谷氨酸脱氢酶是氨基酸分解代谢的中心酶，有助于亮氨酸感应调节自噬。数据表明，谷氨酸脱氢酶活性调节自噬的双重机制，即通过激活MTORC1和限制活性氧的形成。

关键词：AMPK；MTOR；NADPH；氨基酸；线粒体；活性氧物种；信号；转氢酶。

PubMed免责声明

数字

无
图1。敲除GLUD1刺激自噬并抑制MTORC1活性。(A类)免疫印迹分析转染对照（ct）siRNA或总账1小干扰RNA。细胞在完全培养基中培养。如有指示，200 nM巴非霉素A1（BAF）存在2 h以阻止LC3-II的溶酶体降解。ACTB的免疫印迹用作负荷对照。使用Bio-1D定量软件测定LC3-II/ACTB比率。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）*p<0.05。(B类)免疫印迹分析转染对照（ct）siRNA或总账1小干扰RNA。细胞在完全培养基中培养。ACTB的免疫印迹用作负荷对照。使用Bio-1D定量软件测定SQSTM1/ACTB比值。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）*p<0.05。(C类)用对照（ct）siRNA或总账1小干扰RNA。如有指示，200 nM巴非霉素A1（BAF）存在2小时。在50至100个细胞上对每个细胞的GFP-LC3点的数量进行评分。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）*p<0.05。(天)用对照（ct）siRNA或总账1siRNA，在完全培养基中培养。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）*p<0.05。
无
图2。亮氨酸而非缬氨酸抑制自噬。(A类)免疫印迹分析在完整培养基或补充1、5或10 mM亮氨酸或缬氨酸的EBSS中培养的HeLa细胞中LC3-I和LC3-II水平4小时。ACTB免疫印迹用作负荷对照。使用Bio-1D定量软件测定LC3-II/ACTB比率。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）*p<0.05。(B类)在完全培养基或添加10 mM亮氨酸或缬氨酸的EBSS中培养4 h的HeLa GFP-LC3细胞中GFP-LC2染色的代表性图像。在100个细胞上对每个细胞的GFP-LC3dots数量进行评分。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）*p<0.05。
无
图3。敲除GLUD1可防止亮氨酸对自噬的抑制。(A类)在用对照（ct）siRNA（上直方图）或总账1siRNA（较低的直方图）和用完全培养基（CM）、饥饿培养基（EBSS）和饥饿培养基补充10 mM亮氨酸（EBSS+Leu）进行4小时处理。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）**p<0.01。(B类)免疫印迹分析转染对照（ct）siRNA或总账1siRNA培养72小时，并在补充有10 mM亮氨酸或缬氨酸的EBSS中培养4小时。如有指示，200 nM巴非霉素A1（BAF）存在2 h以阻止LC3-II的溶酶体降解。ACTB的免疫印迹用作负荷对照。使用Bio-1D定量软件测定LC3-II/ACTB比率。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）**p<0.01。(C类)用对照（ct）siRNA转染HeLa细胞中SQSTM1水平的免疫印迹分析（上直方图）或总账1siRNA（低直方图），并在完全培养基或添加10 mM亮氨酸的EBSS中培养4小时。ACTB的免疫印迹用作负荷对照。使用Bio-1D定量软件测定SQSTM1/ACTB比值。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）**p<0.01。(天)测量转染对照（ct）siRNA的HeLa细胞中长寿命蛋白质降解情况（上western blot和柱状图）或总账1siRNA（低western blot和直方图）培养72小时，并在完全培养基或补充有10 mM亮氨酸或10 mM 3-甲基腺嘌呤（3-MA）的EBSS中培养。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）*p<0.05。
无
图4。敲除GLUD1可防止亮氨酸刺激MTORC1信号。用对照（ct）siRNA或总账1siRNA并在完全培养基或添加10 mM亮氨酸或缬氨酸的EBSS中培养4小时。柱：平均值；钢筋：SEM（n=3）*p<0.05。
无
图5。通过GLUD1的通量通过促进ROS的消除抑制自噬的诱导。(A类)转染对照（ct）siRNA或总账1如材料和方法（左直方图）所述，用DHE作为探针测量siRNA。转染对照（ct）siRNA或总账1如材料和方法（右直方图）所述，用MitoSOX作为探针测量siRNA。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）*p<0.05。(B类)转染对照（ct）siRNA（左直方图）或总账1如材料和方法所述，用DHE作为探针测量siRNA（右直方图）。细胞在无氨基酸（虚线）或有氨基酸（连续线）的情况下培养45分钟，然后再添加DHE 15分钟(C类)转染对照（ct）siRNA或总账1如材料和方法所述，用MitoSOX作为探针测量siRNA。与染料孵育60分钟后，测定MitoSOX氧化的程度。列：平均值；钢筋：SEM（n=8）**p<0.01。t=0时的背景荧光等于MFI=13.3±0.5。(天)免疫印迹分析转染对照（ct）siRNA或总账1siRNA培养72小时，并在添加10 mM N-乙酰半胱氨酸（NAC）或0.5µM MitoQ的EBSS中培养24小时1（BAF）存在2 h以阻止LC3-II的溶酶体降解。ACTB的免疫印迹用作负荷对照。使用Bio-1D定量软件测定LC3-II/ACTB比率。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）**p<0.01。
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