c-Myc phosphorylation by PKCζ represses prostate tumorigenesis

doi:10.1073/pnas.1221799110

。2013年4月16日；110(16):6418-23.

doi:10.1073/pnas.1221799110。 Epub 2013年4月2日。

PKCζ的c-Myc磷酸化抑制前列腺肿瘤发生

金智英（Ji Young Kim）¹, 塔妮娅·巴伦西亚, 沙迪·阿布·布巴克, 胡安·利纳雷斯, 李桑君（Sang Jun Lee）, 山岛友子, 陈静（音译）, 阿列克谢·厄洛什金, 埃利亚斯·卡斯蒂利亚, 劳伦斯·M·布里尔, 马里奥·梅德韦多维奇, 迈克尔·雷格斯, 豪尔赫·莫斯卡特, 玛丽亚·迪亚兹·梅科

附属公司

PMID： 23550155
预防性维修识别码：下午631641
内政部： 10.1073/pnas.1221799110

PKCζ的c-Myc磷酸化抑制前列腺肿瘤发生

金智英（Ji Young Kim）等。美国国家科学院程序。 2013。

。2013年4月16日；110(16):6418-23.

doi:10.1073/pnas.1221799110。 Epub 2013年4月2日。

作者

附属

¹Sanford-Burnham医学研究所，美国加利福尼亚州拉霍拉市92037。

PMID： 23550155
预防性维修识别码： PMC3631641型
内政部： 10.1073/pnas.1221799110

摘要

研究表明，PKCζ在不同类型的人类癌症中的表达或酶活性降低，支持PKCξ作为肿瘤抑制剂的临床相关性。然而，PKCζ的体内作用及其在前列腺癌中的作用机制尚不清楚。在这里，我们证明，在磷酸酶和张力蛋白同源物缺乏的情况下，小鼠PKCζ的基因失活会导致体内侵袭性前列腺癌。对人类前列腺癌基因表达集的生物信息学分析显示，PKCζ非活性细胞中c-Myc转录活性增加，这与细胞生长、侵袭和转移增加有关。有趣的是，PKCζ的敲除或激酶激活突变体的过度表达通过增加c-Myc mRNA和蛋白水平以及降低c-Myc的Ser-373磷酸化，导致体外细胞增殖和侵袭增强。前列腺癌样本分析表明，PKCζ基因敲除肿瘤中Ser-373处c-Myc的表达增加，磷酸化降低。体内异种移植研究表明，PKCζ的c-Myc磷酸化是控制转移的关键事件。总之，这些结果证明PKCζ是前列腺癌中c-Myc功能的重要抑癌剂和调节剂。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
PKCζ损失与PTEN合作^+/−促进浸润性前列腺癌的发生。(A类)免疫印迹法分析PTEN患者前列腺中PKC水平^+/−和PTEN^+/−/PKCζKO小鼠。(B类)PTEN的代表性前列腺^+/−和PTEN^+/−/8个月龄的PKCζKO小鼠。(C类)10个月龄小鼠和两种基因型小鼠的泌尿生殖道重量：PTEN^+/−(n个=23）和PTEN^+/−/PKCζKO(n个=9）只小鼠*****P（P）*< 0.0001. (D类)所示基因型前列腺的H&E染色。(E类)PTEN中浸润性癌发病率的量化^+/−(n个=7）和PTEN^+/−/PKCζKO小鼠(n个= 15). (F类)所示基因型9月龄小鼠前列腺切片的α-SMA和p63染色(n个= 5). (*G公司*)对所示基因型的9个月龄小鼠前列腺切片进行Ki67染色。(*H（H）*)Ki67阳性细胞的定量。结果是每个小鼠样本10个不同场的平均值±标准差(n个= 5; **P（P）*< 0.05). （比例尺，所有面板中为20μm。）

**图2。**
PKCζ在PCa细胞肿瘤发生中的作用。(A类)PTEN-P2前列腺上皮细胞感染表达HA标记PKCζ（HA-PKCζ）的逆转录病毒或激酶缺失突变的PKCξ（HA-PKCζ-KD），并用所示抗体进行免疫印迹分析细胞裂解物。(B类)在0.1%FCS存在下表达PKCζ-WT或PKCξ-KD的细胞增殖。细胞数用台盼蓝排除法测定。数值是三个不同实验中三次计数的平均值±SEM***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001. (C类)表达PKCζ-WT的细胞在软琼脂中形成集落。通过计数对每个平板的菌落总数进行评分，并用两个独立实验中六个平板的平均值±SD表示。插图是显示菌落大小差异的代表性图片。(D类)表达PKCζ或PKCξKD细胞的细胞周期分析。(E类)在GSE21034数据集中，PKCζ-KD与PKCζ-WT细胞中差异表达的基因（FDR<0.01，倍数变化高于3）与人类同源物。黄色表示高表达水平，蓝色表示低表达水平。(F类)使用表达显著改变的小鼠基因对人类PCa数据集GSE21034进行无监督患者聚类分析，当比较PKCζ-KD与PKCξ-WT时，FDR<0.01且倍数变化大于3。根据特征基因的表达水平是否与PKCζ-KD或PKCξ-WT样本相似，将患者特征分为PKCζ·KD样或PKCζ-样。如果患者样本中特征基因的表达水平与PKCζ-KD样本的相关性更好，则该样本被归类为PKCξ-KD-样，反之亦然。这种分类与样本的疾病状态（正常与肿瘤）之间的相关性具有统计学意义（Fisher精确检验*P（P）*< 0.001).

**图3。**
PKCζ控制细胞运动和侵袭。(A类)PKCζ-KD转录组基于巧妙性的分子和细胞功能显示细胞运动基因显著丰富（秩1，*P（P）*=1.36E-14）。(B类和C类)通过改良的Boyden小室实验测定对照PTEN-P2细胞或表达PKCζ或PKCξ-KD的细胞的侵袭性。结果显示为平均值±SEMn个= 3. ***P（P）*< 0.01. (D类)通过台盼蓝排斥试验测定shNT和shPKCζ感染的DU145细胞的细胞增殖。数值为三个不同实验的三份计数的平均值±SEM***P（P）*< 0.01. (E类和F类)shNT和shPKCζ感染的DU145细胞的侵袭。结果显示为平均值±SEMn个= 3. **P（P）*< 0.05. (*G公司*)在器官型系统中培养的shNT和shPKCζ感染的DU145细胞的H&E染色切片。侵入褶皱的量化(赖特). 结果显示为平均值±SEMn个= 3. ***P（P）*< 0.01. (*H（H）*)使用PKCζ-KD小鼠与PKCξ-WT小鼠中FDR<0.01且倍数变化大于3的基因对人类PCa数据集GSE21034进行无监督患者聚类分析。患者签名分类如图2所示F类这种分类与样本的疾病状态（正常与转移）之间的相关性具有统计学意义（Fisher精确检验*P（P）*< 0.001).

**图4。**
PKCζ调节c-Myc水平。(A类)正常和PCa样本中c-Myc表达数据分布的点图视图。(B类)用Q-PCR定量对照、PKCζ和PKCζ-KD P2细胞中的c-Myc mRNA水平(左侧)和shNT和shPKCζDU145细胞(赖特). 结果显示为平均值±SEM；n个= 3. **P（P）*< 0.05; ***P（P）*< 0.01. (C类)表达shNT和shPKCζ的PC3M和DU145细胞中c-Myc和PKCξ水平的免疫印迹分析。(D类)前列腺切片中c-Myc的免疫染色及染色定量(赖特). 结果为平均值±SEM(n个=5只小鼠****P（P）*<0.001）。（比例尺，20μm）(E类)免疫印迹法检测感染所示shRNA慢病毒载体的DU145细胞的c-Myc、PKCζ和肌动蛋白水平。(F类)通过台盼蓝排斥试验测定感染慢病毒敲除载体的DU145细胞的细胞增殖。数值为三个不同实验的三份计数的平均值±SEM**P（P）*< 0.05. (*G公司*–J型)改良博伊登腔法侵入(*G公司*和*H（H）*)或通过器官型培养(我和J型)用于感染所示shRNA慢病毒载体的DU145细胞。结果显示为平均值±SDn个= 3. ***P（P）*< 0.01. (*K（K）*)用c-Myc荧光素酶报告子转染shNT或shPKCζDU145细胞。荧光素酶活性标准化为*雷尼利亚*活动。数值为两个不同实验的三份计数的平均值±SEM***P（P）*< 0.01. (*L（左）*)PKCζ-KD样本（红色）和其余20693个基因（蓝色）中519个上调基因的Myc累积结合分数分布的比较（FDR<0.05）。具有高累积结合分数（CBS）的上调基因比例明显较高（Kolmogorov–Smirnov检验*P（P）*值=4.3×10⁻¹³)与CBS高但未上调的基因比例相比。

**图5。**
PKCζ对c-Myc磷酸化的功能作用。(A类)PKCζ在体外磷酸化c-Myc。(B类)含有c-Myc pS373位点的磷酸肽的MS/MS光谱。图中显示了碎片离子，以及由于已识别碎片离子而导致的序列覆盖。质量荷电比，*米/z*. (C类)体外PKCζ磷酸化c-Myc的免疫印迹分析。(D类)Ser-373磷酸化位点在不同物种之间高度保守。(E类)所示基因型前列腺切片中磷酸-S373–c-Myc的免疫染色(n个= 5). （比例尺，20μm）(F类)用表达c-Myc、c-Myc–S373A或c-Myc-S373E突变体的逆转录病毒载体感染DU145细胞，通过台盼蓝排斥法测定细胞增殖。数值为三个不同实验的三份计数的平均值±SEM。通过免疫印迹分析细胞裂解物中的c-Myc和肌动蛋白(上部). (*G公司*)在表达c-Myc、c-Myc–S373A或c-Myc-S373E的DU145细胞的器官型培养物中检测侵袭。结果(赖特)显示为平均值±SD(n个= 3 ****P（P）*<0.001）。(*H（H）*)静脉接种表达c-Myc或c-Myc突变体的DU145细胞的小鼠肺切片的H&E染色。注射指定细胞的单个小鼠的肺转移结节总数(赖特)显示为平均值±SEM***P（P）*< 0.01.n个=每组6-7只小鼠。

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