The HPV16 E6 oncoprotein causes prolonged receptor protein tyrosine kinase signaling and enhances internalization of phosphorylated receptor species

doi:10.1371/journal.ppat.1003237

.2013年3月；9（3）：e1003237。

doi:10.1371/journal.ppat.1003237。 Epub 2013年3月14日。

HPV16 E6癌蛋白导致受体蛋白酪氨酸激酶信号传导延长，并增强磷酸化受体物种的内化

詹妮弗·M·斯帕格尔¹, 卡尔·芒格

附属公司

PMID： 23516367
PMCID公司：项目经理3597533
内政部： 10.1371/日志.ppat.1003237

HPV16 E6癌蛋白导致受体蛋白酪氨酸激酶信号传导延长，并增强磷酸化受体物种的内化

詹妮弗·M·斯帕格尔等。公共科学图书馆-病理学. 2013年3月.

.2013年3月；9（3）：e1003237。

doi:10.1371/journal.ppat.1003237。 Epub 2013年3月14日。

作者

詹妮弗·M·斯帕格尔¹, 卡尔·芒格

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院医学部和病毒学委员会，布里格姆女子医院传染病科。

PMID： 23516367
PMCID公司：项目经理3597533
内政部： 10.1371/日志第1003237页

摘要

高危人乳头瘤病毒（HPV）E6蛋白在HPV相关病变和癌症中持续表达。HPV16 E6在生长因子剥夺条件下维持mTORC1和mTORC2信号级联的活性。在此，我们报道了HPV16 E6通过受体蛋白酪氨酸激酶（包括表皮生长因子受体、胰岛素受体和胰岛素样生长因子受体）增强信号转导激活mTORC1。生长因子撤除后数小时内通过这些受体持续发出信号证明了这一点。HPV16 E6增加了激活受体物种的内化，信号衔接蛋白GRB2被证明对HPV16 E6介导的增强EGFR内化和mTORC1激活至关重要。由于受体蛋白激酶介导的mTORC1激活，HPV16 E6表达增加了原代人类上皮细胞的细胞迁移。本研究确定了一种以前未被认可的机制，HPV E6蛋白通过这种机制干扰宿主信号途径，可能在病毒生命周期中维持蛋白质合成，这也可能有助于高危HPV E7蛋白的细胞转化活动。

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利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。表达HPV16 E6的HFK中ERBB2磷酸化增加。**
(A类)从稳定表达HPV16 E6（E6）或pLentiN6.3控制载体（C）的HFK裂解物中提取EGF（左）或PBS饥饿（右）后，对含有磷酸化酪氨酸残基的蛋白质进行Western blot分析。(B类)和(C类)Western blot分析探讨EGFR的磷酸化状态(B类)或INSRβ/IGFRβ(C类)在表达稳定HFK的HPV16 E6（E6）或LXSN控制载体（C）中使用磷酸特异性抗体。三个独立实验的代表性实验显示在面板A、B和C中。与肌动蛋白相关的定量显示在每个面板下方。

**图2。RPTK下游的信号通路在HPV16 E6表达的HFK中被激活。**
(A类)通过分析HPV16 E6（E6）或LSXN对照载体（C）稳定表达的HFK中的ERK1/2和RSK磷酸化，并通过PBS饥饿30分钟经历营养物戒断，对MAPK信号传导进行蛋白质印迹分析。与肌动蛋白相关的定量显示在每个面板下方。显示了总共四个独立实验的代表性实验。(B类)HPV16 E6介导的cap依赖性翻译增加依赖于MEK和mTORC1信号。用pFR_CrPV_xb和指示质粒转染U2OS细胞，并在转染后48小时处理萤火虫和Renilla荧光素酶活性。在裂解前20小时，用DMSO、10µM U0126（MEK抑制剂）或10µM U0126和100 nM雷帕霉素（mTORC1抑制剂）的组合处理细胞。萤火虫和Renilla荧光素酶在二甲基亚砜处理的细胞中被归一化为水平，并表现为归一化萤火虫相对于归一化Renila活性的倍数变化。条形图表示三个独立实验的平均值和标准偏差，每个实验一式三份；星号表示统计学意义(*P（P）*<0.05).

**图3。RPTK抑制减少HPV16 E6表达的HFK中mTORC1的激活。**
(A类)Gefitinib抑制EGFR后，稳定表达HPV16 E6（E6）或pLentiN6.3控制载体（C）的HFK中EGFR和mTORC1激活（S6K）的Western blot分析。用DMSO或1µM吉非替尼处理细胞24小时。肌动蛋白印迹显示为加载控件。这里显示的实验是三个独立实验中的一个。(B类)用OSI-906对INSRβ/IGFRβ进行化学抑制后，稳定表达HPV16 E6（E6）或pLentiN6.3控制载体（C）的HFK中INSR？/IGFR？和mTORC1激活（S6K）的Western blot分析。这些数据代表两个独立实验之一。用DMSO或150 nM OSI-906处理细胞6小时。肌动蛋白印迹显示为加载控制；“肌动蛋白1”对应于带有磷酸特异性抗体的印迹，“肌动素2”对应于其他印迹。

**图4。在表达HPV16 E6的HFK中，活化受体物种的内化和降解增加。**
(A类)受体内化后EGFR和INSRβ/IGFRβ的Western blot分析。用PBS清洗细胞后，将其与生物素二硫化物N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯在4°C下孵育40分钟，然后用NH灭活生物素试剂₄4°C下Cl保持10分钟。然后用缺乏生长因子和补充剂的KSFM在37°C下刺激细胞3小时。在配体非依赖性刺激后，细胞在不还原的情况下进行裂解以测量表面结合受体（S），或还原并裂解以测量配体非独立内化（I），按照材料和方法中的描述进行内化分析。左侧面板（输入）显示了5µg样品中EGFR和INSRβ/IGFRβ的水平，代表内化分析的2%，以及肌动蛋白，右侧面板显示了产生的链霉亲和素纯化（AP）。定量表示磷酸化受体与对照载体（C）内化磷酸化受体归一化总受体的比率，如下所示。这个实验是两个独立实验之一。(B类)隔夜饥饿和Alexa 647标记的EGF（EGF）刺激15分钟后，稳定表达HPV16 E6（E6）或pLentiN6.3控制载体（C）的HFK中EGF与内体标记物EEA1共同染色的免疫荧光分析。细胞用Hoechst染色以观察细胞核。比例尺代表40µm。(C类)面板B中EGF阳性早期内体数量的量化。条形图表示四个独立实验中每个细胞中EGF阴性早期内体的平均数量。共评估115个细胞。误差条表示标准偏差；星号表示统计显著性(*P（P）* = 0.0017).

**图5。信号衔接蛋白GRB2对HPV16 E6介导的EGFR内化和mTORC1激活至关重要。**
(A类)在隔夜饥饿和随后用Alexa 647标记的EGF（EGF）刺激15分钟后，对GRB2缺失（siGRB2）或对照siRNA转染（siCtrl）HFK中稳定表达HPV16 E6（E6）或pLentiN6.3控制载体（C）的EGF与内体标记物EEA1共同染色的EGF免疫荧光分析。细胞用Hoechst染色以观察细胞核。比例尺表示20µm。(B类)从面板A中量化EGF阳性早期内体的数量。条形图表示EGF阳性的早期内体/细胞的平均数量，每种情况下总计至少95个分析细胞进行三次计数。误差线表示标准偏差；星号表示统计显著性(*P（P）* = 0.03). (C类)在稳定表达HPV16 E6（E6）或对照载体（C）的GRB2缺失（siGRB2）或对照siRNA转染（siCtrl）HFK人群中对S6K T389进行Western blot分析。细胞在裂解前48小时转染相应的siRNA。肌动蛋白印迹显示为负载控制，与肌动蛋白相关的定量显示在每个面板下方。面板C显示了从四个独立实验中选取的代表性实验。

**图6。HPV16 E6增加EGF缺失细胞的细胞迁移。**
(A类)在RPTK和效应器通路抑制后，在无EGF的情况下损伤细胞单层后，使用稳定表达HPV16 E6（E6）或感染pLentiN6.3控制载体（C）的初级HFK进行伤口愈合分析。用DMSO或100 nM雷帕霉素、1µM吉非替尼、150 nM OSI-906或10µM U0126处理细胞，并在25小时的时间过程中测量单层的闭合。仅显示DMSO处理样品的图像(B类). 伤口闭合的量化，如所示(A类). 在t=0小时时，伤口表面积相对于伤口表面积进行计算。条形图表示三个实验的平均值和标准偏差；星号表示统计显著性(*P（P）*<0.0001). (C类)在8µg/ml丝裂霉素C存在下对伤口闭合进行定量，以抑制细胞增殖。(D类)稳定表达HPV16 E6（E6）或pLentiN6.3控制载体（C）的永生化HFK伤口闭合的量化(电子). 使用稳定表达HPV16 E6（E6）或pLentiN6.3控制载体（C）的HFK进行跨阱迁移分析。在无EGF的情况下将细胞接种在跨孔插入物的顶室，并在接种后30分钟和60分钟测定无EGF时细胞向底室的迁移。条形图表示三个实验的平均值和标准偏差；星号表示统计显著性(*P（P）*<0.05).

**图7。假设模型。**
与亲代细胞相比，HPV16 E6表达细胞（右）显示RPTK的活化至少部分是通过增强活化受体物种的内化而增强的（左）。因此，下游信号电路，包括mTORC1活性，即使在生长因子可用性有限的情况下也保持活跃。详见正文。

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