Metabolic alterations in lung cancer-associated fibroblasts correlated with increased glycolytic metabolism of the tumor

doi:10.1158/1541-7786.MCR-12-0437-T

.2013年6月；11(6):579-92.

doi:10.1158/1541-7786.MCR-12-0437-T。 Epub 2013年3月8日。

肺癌相关成纤维细胞的代谢改变与肿瘤糖酵解代谢增加相关

维伦德拉·K·乔德里¹, 格雷戈里·萨兹勒, Salihah迪克, 梅兰妮·巴克曼, 拉斐拉·索德拉, 爱德华·D·卡罗利, 罗伯特·莫尼, 布伦登·M·斯蒂尔斯, Olivier Elemento公司, 纳赛尔·阿尔托基, 蒂莫西·麦格劳

附属公司

PMID： 23475953
预防性维修识别码：项目经理3686965
内政部： 10.1158/1541-7786.MCR-12-0437-T

肺癌相关成纤维细胞的代谢改变与肿瘤糖酵解代谢增加相关

维伦德拉·K·乔德里等。摩尔癌症研究. 2013年6月.

.2013年6月；11(6):579-92.

doi:10.1158/1541-7786.MCR-12-0437-T。 Epub 2013年3月8日。

作者

维伦德拉·K·乔德里¹, 格雷戈里·萨兹勒, 萨利哈·迪克, 梅兰妮·巴克曼, 拉斐拉·索德拉, 爱德华·D·卡罗利, 罗伯特·莫尼, 布伦登·M·斯蒂尔斯, Olivier Elemento公司, 纳赛尔·阿尔托基, 蒂莫西·麦格劳

附属

¹美国纽约州纽约市威尔康奈尔医学院生物化学系，邮编：10065。

PMID： 23475953
预防性维修识别码：项目经理3686965
内政部： 10.1158/1541-7786.MCR-12-0437-T

摘要

癌细胞会进行代谢重编程，但对肿瘤内其他细胞的代谢变化知之甚少。我们使用基于质谱的轮廓分析和基于代谢途径的系统分析来比较21个原发性人类肺癌相关成纤维细胞系（CAF）和相邻非肿瘤肺组织产生的“正常”成纤维细胞株（NF）。尽管CAF支持肿瘤的机制尚未阐明，但CAF具有原癌性。我们已经确定了一些代谢产物丰度在全球范围内区分CAF和NF的途径，这表明代谢改变并不局限于癌细胞。此外，我们发现来自高和低糖酵解肿瘤的CAF之间的代谢差异，这可能反映了CAF与肿瘤糖酵分解能力相关的不同作用。其中一个变化是CAFs中二肽的增加。二肽主要来源于蛋白质的分解。我们发现CAF中基础大分子自噬增加，这可能是二肽增加的原因。此外，我们还发现CAF和NFs在降低葡萄糖促进的自噬诱导方面存在差异。总之，我们的数据表明，自噬增加可能是CAF和NF之间代谢差异的原因，并可能在肺癌中发挥其他尚未确定的作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。原发性非永生人肺CAF和成对NF**
**答：。**创建研究中使用的CAF和NF线的方案流程图。B。来自肺肿瘤（CEM23）的分散细胞在培养物中维持所述时间。细胞被固定、渗透并染色以检测波形蛋白（红色）和角蛋白（绿色）。箭头显示，在培养14天时，有一簇角蛋白阳性细胞未传代。图像采集时间为20×。**C、。**在培养中重复传代后，B组显示肿瘤细胞和相应的非肿瘤组织。细胞固定、渗透和染色如下。显示了相同的单元格字段。在左边的图像中，角蛋白呈假红色，中间的图像中波形蛋白呈红色，右边的波形蛋白为红色和αSMA绿色。在所有图像中，DNA染色都是伪蓝色。在使用的培养条件下，波形蛋白阳性细胞增殖，而原始培养物（来自肿瘤和非肿瘤组织）的角蛋白阳性细胞则不增殖。因此，只有波形蛋白阳性细胞在重复*在体外*扩展文化的段落。在所示的例子中，CEM23 CAF高度表达αSMA，这是活化成纤维细胞的标记特征，而配对的CEM23 NF没有表达。以40倍采集图像。各个颜色的强度在所有图像中的缩放比例相同。D。来自两个不同CAF和NFs对的细胞在体外多次传代后，进行波形蛋白（红色）、αSMA（绿色）和DNA（蓝色）染色。显示了每对CAF和NF的两个不同字段。这些数据说明了不同CAF和NF之间αSMA表达的异质性。在这两种情况下，CAF表达的αSMA多于配对NF。与CEM254相比，CEM248 CAF的αSMA表达相当均匀。一些CEM254 NF表达大量αSMA，而CEM254 nf的αSMA表达水平很低。E。通过Western blotting检测6对不同CAF和相应NF中caveolin-1的表达。抗体检测到约20000道尔顿的双抗体。肌动蛋白印迹可用于控制每条车道上装载的提取物数量。F类来自三种不同CAF和NF对的细胞在体外多次传代后，进行小窝蛋白-1（绿色）和DNA（蓝色）染色。无论是在亚细胞定位还是在每个细胞的数量上，CAF和NFs之间的小窝蛋白-1表达都没有一致的差异。以40倍采集图像。在所有图像中，每个荧光颜色的强度都是相同的。

**图2。CAF和成对NF中的稳态代谢物特征**
**答：。**21对CAF和NF中203种代谢物丰度的热图。每种代谢物的丰度按比例定为中值1。色阶如下所示。CEM编号是细胞系标识符。203种代谢物的列表见补充表一。热图面板以较大的格式显示在补充图1A中。B。所有203种代谢物在CAF和NF中的分布。**C、。**203种代谢物的“相对”t核分布分为7个生化分组（补充表I）。各组代谢物的数量如图所示（n）。为了显示目的，从所分析组的代谢物的t-核中减去不在所分析组中的（203-n）代谢物平均t-核。因此，将7条主要路径中每一条的t核分布与其自身的参考集进行比较。这样，相对于0的t核偏移越远，与参考集的差异越大。右图所示为经Benjamini-Hochberg修正的双尾非配对p值，用于对7组代谢物的t核分布与其余代谢物t核分布的比较进行多重测试。**D&E公司。**t核分布的代谢物亚群(D类)和丰度变化（对数₂（CAF/NF）(E类)在p值≤0.05时，两者都不同于其参考数据（经多次测试校正的双尾未配对p值Benjamini-Hochberg）。显示了子组（n）中代谢物的数量。所有46个亚组的结果如补充图2所示。

图3。*高肿瘤SUV_最大值（SUV*≥8）与减少相关*无病生存*
2000年2月至2009年12月581名非小细胞肺癌患者的无病生存率（按SUV分类）_最大值（SUV≥8:n=231；SUV≤5:n=350；中位随访23个月）。

**图4。代谢组分析揭示肿瘤SUV的影响_最大值关于CAF和NF**
**答：。**11对CAF/NF与SUV肿瘤相关的比较_最大值≥ 8. 其t核分布（顶面板）和丰度变化（对数）的代谢物亚群₂（CAF/NF）（底部面板）在p值≤0.05时均与参考数据不同（经多次试验校正的双尾未配对p值Benjamini-Hochberg）。B。SUV肿瘤相关的7对CAF/NF的比较_最大值≤ 5. 其t核分布（上面板）和丰度变化分布（对数）的子群₂（CAF/NF）（下图）在p值≤0.05时均与参考数据不同（显示了Benjamini Hochberg针对多次测试校正的双尾未配对p值）。子组（n）中的代谢物数量如左图所示。**C、。**高SUV 11个CAF的比较_最大值低SUV（≥8）至7个CAF_最大值（≤5）个肿瘤。其t核分布（上面板）和丰度变化分布（对数）的子群₂（CAF/NF）（下面板）在p值≤0.05时均与参考数据不同（经多次试验校正的双尾未配对p值Benjamini-Hochberg）。子组（n）中的代谢物数量如左图所示。D类.来自具有高SUV的个体的11个NFs的比较_最大值低SUV个体的7个NF（≥8）肿瘤_最大值（≤5）个肿瘤。其t核分布（上面板）和丰度变化分布（对数）的子群₂（CAF/NF）（下面板）在p值≤0.05（经多次试验校正的双尾未配对p值Benjamini-Hochberg）时均与参考数据不同。子组（n）中的代谢物数量如左图所示。

**图5。相对于成对NF，CAF中的LC3II增加**
**答：。**用于LC3I和LC3II定量的CAF/NF对（CEM 217）的代表性LC3 western blot。数据来自生长培养基中的细胞，反映了LC3的基本稳态水平，以及来自用10μM氯喹处理3小时以抑制LC3II降解的细胞。B。用定量Western印迹法测定8种成纤维细胞株中LC3（LC3I和LC3II）的总量。这些值被归一化为总蛋白（肌动蛋白）。数据是至少3次测量的平均值±SEM。**C、。**LC3II占NF和成对CAF中总LC3（I+II）的百分比，这是通过量化如面板a所示的Western blot确定的。所有11NF/CAF对的平均值，以及与低SUV相关的4对NF/CAF_最大值肿瘤和7对与高SUV相关_最大值显示肿瘤。*p<0.01。D。LC3免疫荧光成像自噬体。对照细胞（生长培养基）或在不含葡萄糖或谷氨酰胺的DMEM培养基中孵育3小时后的细胞的代表区域用LC3抗体染色。含有LC3II的自噬体显示为绿色。使用40倍物镜收集图像。细胞之间的强度差异反映了LC3染色量的差异。DAPI染色细胞核显示为蓝色。E。在无葡萄糖和谷氨酰胺的培养基中培养3小时对通过Western blotting测定的LC3II百分比的影响。数据是4对CAF/NF对±SEM数据的平均值。*p<0.05，配对，单尾学生t检验。

**图6。葡萄糖对自噬的影响**
**答：。**LC3荧光检测生长培养基中葡萄糖对自噬体的影响。显示了在5 mM、25 mM葡萄糖中生长或在无葡萄糖和谷氨酰胺的培养基中培养3小时后生长的细胞的典型图像。显示强度伪彩色图像。彩色比例尺位于面板A的底部。图像以40×的速度采集。B类.用质谱法从在25 mM或5 mM葡萄糖中至少生长7代的细胞中定量17种二肽。*p<0.05，配对，双尾学生t检验。C类在18小时培养期间，荧光葡聚糖从培养基中内吞，然后在不含葡聚糖的培养基中再培养3小时，将其追赶到溶酶体中的典型表观荧光图像。显示了在25和5 mM葡萄糖中生长的细胞。图像以40×。DAPI染色细胞核显示为蓝色。D类通过摄入罗丹明-荧光素（R/F）标记葡聚糖的比率荧光显微镜测定7对NF/CAF溶酶体的pH值。数据是8个CAF/NF对（5 mM葡萄糖）和2个CAF-NF对（25 mM糖）的平均溶酶体pH值的平均值。

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