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临床试验
.2013年3月1日；19(5):1244-56.
doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-3149。 Epub 2013年2月19日。

同时阻断表皮生长因子受体和环氧合酶-2信号通路预防头颈癌的临床前和临床研究

董敏欣 1, 张洪政, 纳比尔·F·萨巴, 艾米·Y·陈, Sreenivas Nannapaneni公司, A R M Ruhul Amin先生, 苏珊·米勒, 梅琳达·刘易斯, 加布里埃尔·西卡, 斯科特·科诺, 约翰·布兰德斯, 威廉·格里斯特, 雷切尔·莫雷诺-威廉姆斯, 乔纳森·贝特勒, 苏菲·M·托马斯, 陈正佳, Hyung Ju C Shin先生, 詹妮弗·格兰迪斯, 法德洛·R·库里, 卓乔治亚·陈
附属公司
临床试验

同时阻断表皮生长因子受体和环氧合酶-2信号通路预防头颈癌的临床前和临床研究

董敏欣等。 临床癌症研究. .

摘要

目的：我们研究了结合EGF受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKI）和环氧合酶-2抑制剂（COX-2I）的新型化学预防策略的疗效和潜在分子机制。

实验设计：我们利用头颈癌细胞系和预防性异种移植模型，研究了EGFR-TKI（埃洛替尼）和COX-2I（塞来昔布）联合治疗对肿瘤细胞生长的抑制作用。我们研究了这些药物的抗血管生成活性，并通过肿瘤细胞裂解物的免疫印迹分析、小鼠异种移植组织和血液的免疫组织化学（IHC）和酶免疫分析（EIA）来检测受影响的信号通路。通过IHC、EIA和抗体阵列分析，对埃洛替尼和塞来昔布第一阶段化学预防试验参与者的样本中的生物标记物进行了研究。

结果：在细胞系和异种移植模型中，联合治疗对头颈癌细胞生长的抑制作用明显强于单一药物，并且比单一药物对G1期细胞周期进展的抑制作用更强。联合治疗调节EGFR和mTOR信号通路。厄洛替尼和塞来昔布联合用药的I期化学预防试验显示，在数据分析时，总体病理反应率为71%。对参与者组织样本的分析一致显示，治疗后EGFR、pERK和pS6水平下调，这与临床反应相关。

结论：厄洛替尼联合塞来昔布治疗通过抑制EGFR和mTOR通路提供了一种有效的化学预防方法，可作为潜在的生物标志物来监测这种联合治疗在临床上的干预作用。临床癌症研究；19(5); 1244-56. ©2013 AACR。

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数字

图1
图1。厄洛替尼和塞来昔布对SCCHN细胞生长的影响
SCCHN细胞株Tu212（A）和Tu686（B）按照方法一节所述，分别用1:2系列稀释液厄洛替尼（0-40μM）和塞来昔布（0-20μM）作为单一制剂和联合制剂进行处理。孵育72小时后，使用SRB分析测定相对于未处理细胞的存活率。使用CalcuSyn软件计算有效剂量的CI，其抑制率为50%（ED50）、75%（ED75）和90%（ED90）（1-存活率）。CI值>1表示拮抗，=1表示可加性，<1表示协同。
图1
图1。厄洛替尼和塞来昔布对SCCHN细胞生长的影响
SCCHN细胞株Tu212（A）和Tu686（B）按照方法一节所述，分别用1:2系列稀释液厄洛替尼（0-40μM）和塞来昔布（0-20μM）作为单一制剂和联合制剂进行处理。孵育72小时后，使用SRB分析测定相对于未处理细胞的存活率。使用CalcuSyn软件计算有效剂量的CI，其抑制率为50%（ED50）、75%（ED75）和90%（ED90）（1-存活率）。CI值>1表示拮抗，=1表示可加性，<1表示协同。
图2
图2。厄洛替尼和塞来昔布诱导SCCHN细胞G0/G1期阻滞
SCCHN细胞株Tu212（A）和Tu686（B）用厄洛替尼（1μM）、塞来昔布（10μM）及其联合治疗24、48和72小时。如方法部分所述，采用流式细胞仪进行细胞周期分析。用三次重复实验的标准偏差表示每个时间点G0/G1时细胞群的平均百分比。重大差异(第页≤0.05），与对照组进行比较，显示所有时间点的每个单一治疗。（C） 治疗24、48和72小时的Tu212和Tu686细胞中细胞周期调节蛋白的Western blot分析。实验重复了三次。
图2
图2。埃洛替尼和塞来昔布诱导SCCHN细胞G0/G1阻滞
SCCHN细胞株Tu212（A）和Tu686（B）用厄洛替尼（1μM）、塞来昔布（10μM）及其联合治疗24、48和72小时。如方法部分所述，采用流式细胞仪进行细胞周期分析。用三次重复实验的标准偏差表示每个时间点G0/G1时细胞群的平均百分比。重大差异(第页≤0.05），与对照组进行比较，显示所有时间点的每个单一治疗。（C） 治疗24、48和72小时的Tu212和Tu686细胞中细胞周期调节蛋白的Western blot分析。实验重复了三次。
图2
图2。厄洛替尼和塞来昔布诱导SCCHN细胞G0/G1期阻滞
SCCHN细胞株Tu212（A）和Tu686（B）用厄洛替尼（1μM）、塞来昔布（10μM）及其联合治疗24、48和72小时。如方法部分所述，采用流式细胞仪进行细胞周期分析。用三次重复实验的标准偏差表示每个时间点G0/G1时细胞群的平均百分比。重大差异(第页≤0.05），与对照组进行比较，显示所有时间点的每个单一治疗。（C） 治疗24、48和72小时的Tu212和Tu686细胞中细胞周期调节蛋白的Western blot分析。实验重复了三次。
图3
图3。厄洛替尼和塞来昔布对SCCHN细胞信号转导通路的影响
用厄洛替尼（E:1μM）、塞来昔布（C:10μM）及其联合用药（EC）处理24、48和72小时后，从SCCHN细胞系Tu212和Tu686收集细胞裂解物。在每个时间点使用未处理细胞（NT）作为对照。对每个时间点的总蛋白提取物进行Western blot分析，以检测EGFR、AKT、mTOR和COX-2通路相关蛋白的表达水平。β-actin作为负荷控制。
图4
图4。厄洛替尼和塞来昔布对HUVEC小管形成和基质浸润的抑制作用
（A） 检测厄洛替尼和塞来昔布对HUVEC毛细血管形成的影响在体外HUVEC用载体DMSO（对照）、塞来昔布（CCB:10μM）、埃洛替尼（ER:1μM）及其组合（Comb）预处理12小时，然后接种在预先涂有Matrigel的24孔板中并培养过夜。图中显示了一幅具有代表性的图像。使用奥林巴斯倒置显微镜（CKX40；奥林巴斯，纽约州纽约市）计算了10个领域中HUVEC毛细血管分支的平均数量。（B） 将悬浮在含有0.1%牛血清白蛋白（含或不含二甲基亚砜）（对照）、塞来昔布（CCB:10μM）、埃洛替尼（ER:1μM）或埃罗替尼与塞来昔布联用（梳：分别为1μM和10μM）的无血清培养基中的HUVEC一式三份接种于侵袭室。培养36-40小时后，计数入侵细胞的数量，并将其量化为放大200倍显微镜下10个随机场的总和。实验重复两次。*表明治疗组与对照组相比有统计学意义（p<0.05）。
图5
图5。厄洛替尼和塞来昔布对Tu212异种移植瘤生长的影响
在皮下接种2×10之前，将四组小鼠分别灌胃给对照组（0.1%吐温80和0.5%甲基纤维素）、厄洛替尼（75 mg/kg）、塞来昔布（50mg/kg）或厄洛替布（75 mg/kg/kg）和塞来昔卜（50 mg/kg）的组合（n=8）6天6Tu212细胞。每周5天，连续给动物灌胃药物，共4周。（A） 在指定的时间点测量肿瘤体积。（B） 对增殖标记Ki-67、mTOR底物p-S6和内皮标记CD34的表达进行免疫组织化学分析，显示为代表性H&E染色（×200）。（C） 这些生物标记物的量化。*表示治疗组与对照组相比具有统计学意义（p<0.05），**表示联合用药与任一单药之间存在显著差异。
图6
图6。厄洛替尼和塞来昔布联合治疗后患者组织样本中生物标志物的变化
（A） 联合治疗前后EGFR、pERK和p-S6的免疫组化染色。（B） EGFR、pERK和p-S6表达变化与患者在最后一个临床时间点的反应的相关性。分析中包括7名患者。（C） 与临床反应相关的重要蛋白质的热图（p<0.1）。
图6
图6。厄洛替尼和塞来昔布联合治疗后患者组织样本中生物标志物的变化
（A） 联合治疗前后EGFR、pERK和p-S6的免疫组化染色。（B） EGFR、pERK和p-S6表达变化与患者在最后一个临床时间点的反应的相关性。分析中包括7名患者。（C） 与临床反应相关的重要蛋白质的热图（p<0.1）。
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