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。2014年1月30日；33(5):556-66.
doi:10.1038/onc.2012.635。 Epub 2013年1月28日。

肿瘤抑制剂Rb对谷氨酰胺代谢的控制

M R雷诺 1, A N车道 2, B罗伯逊 三, S坎普 三, Y刘 4, B G希尔 5, D C院长 6, B F克莱姆 1
附属公司

肿瘤抑制剂Rb对谷氨酰胺代谢的控制

M R雷诺等人。 癌基因。 。

摘要

视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白是一种在大多数人类癌症中失调的肿瘤抑制因子。Rb部分通过直接禁用细胞周期促进转录因子E2F家族来抑制细胞周期进展。由于细胞周期进展需要多个谷氨酰胺衍生合成代谢前体的从头合成，我们假设Rb也可能直接调节参与谷氨酰胺代谢的蛋白质。我们检测了从所有三个Rb家族成员（Rb-1、Rbl1和Rbl2）都有三重敲除（TKO）的小鼠中分离出来的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中的谷氨酰胺代谢，发现整体Rb功能的丧失导致了（13）C-谷氨酰胺摄取量的显著增加，并将其纳入谷氨酸和三羧酸循环（TCA）中间产物部分通过上调谷氨酰胺转运体ASCT2的表达和谷氨酰胺酶1（GLS1）的活性。Rb-controlled transcription factor E2F-3通过直接调节ASCT2 mRNA和蛋白表达来改变谷氨酰胺摄取，并且观察到E2F-3与ASCT2启动子相关。接下来，我们研究了谷氨酰胺摄取和利用增加所观察到的功能后果，发现谷氨酰胺暴露会显著增加耗氧量，而谷氨酰胺剥夺会选择性降低Rb TKO MEF中的ATP浓度，但不会降低野生型（WT）MEF中ATP浓度。此外，TKO MEF表现出外源性谷氨酰胺产生的谷胱甘肽增加，并且相对于WT MEF，γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶的表达增加。重要的是，Rb TKO MEF的增殖需要向谷氨酰胺利用的代谢转变，而WT MEF则不需要。最后，在Rb TKO MEF中添加TCA循环中间产物α-酮戊二酸，可以逆转谷氨酰胺剥夺对ATP、GSH水平和生存能力的抑制作用。总之，这些研究表明Rb/E2F级联直接调节肿瘤生长所需的主要能量和合成代谢途径。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

作者表示，这些研究不存在利益冲突。

数字

图1
图1。Rb家族的缺失通过提高ASCT2表达和GLS1活性促进谷氨酰胺的摄取和转化为谷氨酸
a。野生型的谷氨酰胺摄取，Rb-1−/−TKO细胞通过14C-谷氨酰胺标记。数据表示为nmol/min/mg蛋白质。三种独立细胞制剂的三次重复测量的平均值±标准差*p<0.005。b。在Rb-1中测定谷氨酰胺摄取−/−Rb-1表达重建后的TKO细胞。数据表示为nmol/min/mg蛋白质。三种独立细胞制剂的三次重复测量的平均值±标准差*p<0.01。c。WT和TKO MEF之间ASCT2和SLC38A5的mRNA表达。对于ASCT2和SLC38A5比较，数据表示为WT水平设置为1的相对mRNA。WT和TKO MEF之间ASCT2的蛋白表达表示为WT水平设置为1的相对蛋白表达。对于蛋白质表达，显示了三个独立实验的代表性图像*p<0.01。d。对于GLS，mRNA水平与设置为1的WT GLS1的表达相关。对于mRNA，所示为三种独立RNA制剂的平均值±标准差。WT和TKO MEF之间GLS1的蛋白表达表示为WT水平设置为1的相对蛋白表达。对于蛋白质表达，显示了三个独立实验的代表性图像*p<0.01。e、。在WT和TKO细胞培养基中测定分泌氨水平。数据表示为nmol/min/mg蛋白质，显示为两个独立实验三次测量的平均值±标准差*p<0.005。f、。通过稳定同位素标记WT和TKO细胞，用[13C类5,15N个2]-谷氨酰胺，如方法中所述。所示为代表谷氨酸的峰的代表性二维核磁共振谱。这些盒子连接13谷氨酸的C卫星峰和指示的中心峰12C来自谷氨酸，不含13C、。
图2
图2。Rb通路缺失增加谷氨酰胺碳的TCA再补体并刺激线粒体代谢
a。通过稳定同位素标记WT和TKO细胞，用[13C类5,15N个2]-谷氨酰胺，如方法和图1所述。显示了对应于天冬氨酸C2-C3和13C卫星。该模式表明，完全标记的天冬氨酸通过Krebs循环的第一轮与天冬氨酸酯的混合物，显示了OAA与未标记的乙酰辅酶a从未标记葡萄糖中缩合后Krebs周期的第二轮，如图1所示。b。WT与TKO细胞中的稳态ATP水平。数据表示为pmol/mg蛋白质，显示为三个独立实验重复测量的平均值±标准差*p<0.01。c。O（运行）2在Seahorse XF 24分析仪上测量WT和TKO细胞的消耗量，并将耗氧率（OCR）归一化为蛋白质含量，数据表示为pmol/min/µg蛋白质。显示的是来自两个独立实验的五个重复的平均值±s.e.m。ATP连接、最大（储备）和非线粒体O2分别通过添加寡霉素、FCCP和AA/鱼藤酮来测定组分*p<0.01。d。O（运行）2将外源性谷氨酰胺添加到WT和TKO细胞后测量消耗量。所示为基线耗氧量百分比（设定为100%）与两个独立实验的5个重复时间的函数关系。e、。使用线粒体或核特异性基因的引物，通过实时PCR测定WT和TKO细胞之间线粒体DNA与核DNA的相对数量。图中所示为四种不同细胞制剂中mtDNA/核DNA的比率，WT设置为1*p<0.005。
图3
图3。Rb-家族缺陷细胞的ROS水平升高，谷胱甘肽总量增加，GSH与谷胱甘苷总量的比值降低
a。测量DCF荧光的WT或TKO的代表性流式细胞术直方图。%阳性细胞是指染色细胞数超过未染色细胞数。b。用FlowJo软件测定WT和TKO细胞之间的平均荧光强度（MFI）。数据表示为来自两个单独实验的重复测量的平均值±标准差*p<0.01通过测量DCF荧光随时间的变化来确定整个WT或TKO细胞中ROS的生成速率。数据表示为相对FU/min/mg蛋白质，表示为三个独立实验中5个重复的平均值±标准差*p<0.01。c。线粒体特异性ROS指示剂MitoSOX染色WT和TKO MEF的MFI。数据表示为来自两个单独实验的三个重复的平均值±标准差。d。按照材料和方法中的描述测量总谷胱甘肽。数据表示为WT和TKO细胞之间的µg/mg蛋白质。所示为两个单独实验的三个重复的平均值±标准差。*p<0.005 e、。γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCLC）的蛋白表达。图中所示为来自三种独立细胞裂解液制剂的代表性图像，表达比率通过密度分析确定，WT表达设置为1。f、。GSH/总谷胱甘肽的比率按照材料和方法中的描述进行测量。数据表示为WT和TKO细胞之间GSH/总谷胱甘肽的比率。所示为两个单独实验的三个重复的平均值±标准差。p<0.01。
图4
图4。Rb功能丧失导致细胞依赖谷氨酰胺维持细胞生存和生长以及维持细胞稳态ATP水平
WT和TKO细胞在无谷氨酰胺培养基中培养指定的时间段。a。台盼蓝染色后用血细胞计数仪计数活细胞数。数据表示为来自三个独立实验的三次测量的平均活细胞数±s.d*p<0.005 b根据材料和方法中的描述，在WT和TKO细胞之间测定稳定状态的ATP。所示为两个不同实验三次读数的平均值±标准偏差*p<0.01。
图5
图5。α-酮戊二酸钠在缺乏Rb家族细胞谷氨酰胺撤除期间拯救ATP生成、GSH水平和细胞存活
TKO细胞在无谷氨酰胺培养基中培养指定的时间段，添加或不添加7mM二甲基-α-酮戊二酸。a。台盼蓝染色后用血细胞计数仪计数活细胞数。数据表示为来自三个独立实验的三次重复测量的平均活细胞数±标准差*p<0.005。b根据材料和方法中的描述，在WT和TKO细胞之间测定稳定状态的ATP。数据以µM/mg蛋白质表示，所示为两个不同实验三次读数的平均值±标准偏差*p<0.01。c。在完全培养基、缺乏谷氨酰胺的培养基或缺乏谷氨酰胺并添加α-KG的培养基中培养24小时的TKO MEF的代表性流式细胞术直方图。d。在没有或存在谷氨酰胺或α-KG的情况下培养的TKO MEF的平均荧光强度。数据以两个单独实验的三份读数的平均值±标准差表示*p<0.01。e（电子）在指定的培养基条件下培养24小时后，TKO MEF中的GSH水平。数据表示为不同条件下的相对谷胱甘肽水平，+GLN样本设置为1，所示为两个单独实验三次测量的平均值±标准差*p<0.005。
图6
图6。E2F家族成员通过直接调节谷氨酰胺水解酶的表达促进无功能Rb细胞谷氨酰胺代谢
a。E2F-1、-2和-3在WT和TKO细胞中的蛋白表达。显示了三个独立实验的代表性图像，以及WT水平设置为1时相对蛋白质表达的密度测定分析*p<0.01。b。用E2F-1、-2或-3特异性siRNA瞬时转染TKO细胞，检测ASCT2和GLS1蛋白的表达。显示了三个独立实验的代表性图像，并将每个蛋白质相对表达的密度测定分析与非siRNA对照进行了比较，后者设置为1。c。在siRNA转染72小时后，台盼蓝染色后，通过血细胞计数仪测定活细胞数。每种情况下的数据均表示为相对活细胞数（平均值±标准差），而无siRNA对照组的数据设置为1*p<0.05。d。谷氨酰胺摄取量通过14转染E2F-1、-2和-3 siRNA 72小时后，TKO细胞中的C-谷氨酰胺标记。数据表示为与无siRNA对照相比的谷氨酰胺相对摄取量（平均值±标准日），设定为1*p<0.01。e、。E2F-1、-2或-3与小鼠启动子的关联ASCT2，cdc2和GAPDH公司用染色质免疫沉淀分析法检测TKO细胞中的基因。使用启动子特异性引物对输入或洗脱的染色质进行实时PCR分析。数据表示为来自三种不同染色质制剂的每个基因的免疫沉淀染色质输入百分比。*p<0.005。
图7
图7。Rb调节谷氨酰胺裂解过程中不同节点的谷氨酰胺代谢
Rb途径通过E2F-3介导的谷氨酰胺转运体ASCT2的调节部分控制谷氨酰胺的消耗。在细胞内，谷氨酰胺具有多种下游生化命运，包括谷胱甘肽，作为TCA循环的补体碳，以及核苷酸和氨基酸。Rb级联可以通过调节γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCLC）的表达来调节谷胱甘肽的合成，这是谷胱甘苷生成的速率限制步骤。对于TCA缺失，谷氨酰胺在线粒体中通过另一种Rb家族调节酶谷氨酰胺酶1（GLS1）转化为谷氨酸，并可以作为α-酮戊二酸进入TCA循环。在TCA中，谷氨酰胺衍生的碳可以进一步代谢为草酰乙酸以转化为额外的氨基酸，或者与丙酮酸的乙酰辅酶a（AcCoA）结合以合成柠檬酸盐，这是脂肪酸（FA）生产的前体。最终，通过调节葡萄糖和谷氨酰胺代谢，Rb途径可能不仅通过控制细胞周期进程，而且通过促进细胞分裂所需的能量和大分子的产生，有效地调节细胞生长。ASCT2：钠依赖性中性氨基酸转运蛋白2型；半胱氨酸：半胱氨酸；全日空航空公司4+：铵；GSH：还原型谷胱甘肽；Gln：谷氨酰胺；Glu：谷氨酸；TCA：三羧酸循环
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