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.2013年5月；169(1):197-212.
doi:10.1111/bph.12114。

β-catenin途径参与瘦素对大鼠肝星状细胞SREBP-1c表达和肝纤维化的影响

徐光斋 1, 严坤峰, 纪业范, 牛明慧, 钱周, 兖州, 陈洪山, 周亚军
附属公司

β-catenin途径参与瘦素对大鼠肝星状细胞SREBP-1c表达和肝纤维化的影响

徐光斋等。 杂志. 2013年5月.

摘要

背景和目的：肝纤维化通常与肥胖有关，大多数肥胖患者会出现高瘦素血症。脂肪细胞因子瘦素在肝纤维化的发展中具有独特的作用。肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化发生的关键步骤，甾醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）可以抑制HSC的激活。我们已经证明，瘦素强烈抑制大鼠HSC中SREBP-1c的表达。因此，我们旨在阐明脂肪细胞分化的关键负调控因子β-catenin途径是否介导瘦素对HSC和小鼠肝纤维化中SREBP-1c表达的影响。

实验方法：HSC由大鼠和小鼠制备。通过实时PCR、Western blot分析、免疫染色和瞬时转染分析分析基因表达。

主要成果：瘦素增加了培养HSC中的β-catenin蛋白，但不增加mRNA水平。瘦素诱导Ser（9）糖原合成酶激酶-3β磷酸化，随后β-catenin蛋白的稳定至少部分由ERK和p38 MAPK途径介导。瘦素诱导的β-catenin途径降低了SREBP-1c的表达和活性，但不影响控制SREBP-1活性的关键调控因子的蛋白水平，也不参与瘦素对肝脏X受体α的抑制。在小鼠肝损伤模型中，β-catenin通路被证明参与了瘦素诱导的肝纤维化。

结论和影响：β-catenin途径有助于瘦素调节HSC中SREBP-1c的表达和小鼠瘦素诱导的肝纤维化。这些结果对阐明与瘦素水平升高相关的肝纤维化发生机制具有潜在意义。

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数字

图1
图1
瘦素治疗增加培养HSC中β-catenin蛋白水平和活性，但不增加β-catentin mRNA水平。（A，B）β-catenin水平的Western blot分析。用100 ng·mL培养HSC−1瘦素或10 mM氯化锂用于不同的时间段（A）或不同浓度的瘦素用于24小时（B）。显示了三个独立实验的代表。（C） β-连环蛋白的免疫荧光染色。用或不用100 ng·mL处理HSC后−1用抗β-catenin一级抗体和DyLight488-结合二级抗体（绿色荧光）对瘦素作用24h后的β-catentin蛋白进行免疫荧光染色。细胞核用Hoechst 33342（蓝色荧光）进行复染。代表性图像来自三个独立的实验。比例尺25μm。（D） β-catenin反激活活性的转染分析(n个= 6). 用质粒pGL3-OT或pGL3-OF+pRL-TK转染HSC，然后用不同浓度的瘦素处理24 h。荧光素酶活性表示正常化为内部对照pRL-TK活性后用pGL3-OT和pGL3-OFF检测到的信号的比率。所有值均表示为平均值±SD*P（P）与不含瘦素的对照组相比，<0.05。（E） β-catenin mRNA水平的实时PCR分析(n个= 3). 用或不用100 ng·mL培养HSC−1不同时间段的瘦素水平。所有值均表示为平均值±SD*P（P）>0.05与相同时间点无瘦素的相应对照组相比。
图2
图2
β-儿茶素是瘦素抑制培养的HSC中SREBP-1c[前体SREBP-1c（前SREBP-1c），125kDa]基因表达所必需的。（A，B）β-catenin（A）蛋白水平和SREBP-1c前体形式的蛋白质印迹分析（B）。在用瘦素（100 ng·mL）治疗前，用不同浓度的XAV939预孵育HSC−1)再进行24小时。结果代表了三个独立的实验。（C） SREBP-1c mRNA水平的实时PCR分析(n个= 3). 在使用或不使用瘦素（100 ng·mL−1)额外24 h。所有值均表示为平均值±SD*P（P）与仅含瘦素的细胞相比，<0.05（左侧第一列）。（D） SREBP-1c启动子活性的转染分析(n个= 6). 用固定量的DNA混合物（包括0.8μg pSREBP1c-Luc、不同剂量的pwtcatenin（pwtcat）或pdncatenin。所有值均表示为平均值±SD*P（P）与仅含瘦素的细胞相比，<0.05（左侧第一列）。（E） 前SREBP-1c蛋白水平的Western blot分析。将HSC与递增剂量的氯化锂孵育12小时。结果表明，三个独立实验具有代表性。（F） SREBP-1c启动子活性的转染分析(n个= 6). 用pSREBP1c-Luc和pRL-TK转染HSC，然后用或不用LiCl孵育12 h。所有值均表示为平均值±SD*P（P）<0.05，与不含氯化锂的细胞相比。
图3
图3
在TAA诱导肝损伤的ob/ob小鼠模型中，瘦素抑制HSC中SREBP-1c基因表达需要β-连环素。Ob/Ob小鼠随机分为四组：第一组（TAA+Ad.Fc）；第2组（TAA+瘦素+Ad.Fc）；第3组（TAA+瘦素+Ad.Dkk-1）；第4组（含TAA+Ad.Dkk-1）。小鼠注射TAA（200μg·g−1体重，i.p.，每周两次）或瘦素（1μg·g−1体重，每天一次），持续4周。Ad.Dkk-1或Ad.Fc（2×107pfu·g−1体重，每2周注射一次）。Ad.Fc被用作对照病毒。治疗4周后，通过以下方法检测HSC中SREBP1c或β-catenin的蛋白：（A）用ABC法在肝切片上对SREBP1c进行单一染色。每组的代表性图片(n个=6）显示SREBP-1c阳性的窦周细胞，呈星状投射（箭头所示）。比例尺25μm。（B） HSC中SREBP1c蛋白水平的Western blot分析[pre-SREBP1c，125kDa；核活性形式（nSREB1c），68kDa]或β-catenin。从四组中分离出HSC，并直接用于通过Western blot分析SREBP1c或β-catenin的蛋白水平。显示了三个独立实验的代表性图像。（C） 双荧光染色用于检测和定量SREBP-1c阳性HSC。用抗SREBP1c的一级抗体和抗突触素（SYP，静止和活化HSC的标记物）的一级抗原，以及随后用DyLight594结合的二级抗体（红色荧光），对肝切片进行双重荧光染色，检测SREBP-1c阳性HSC和DyLight488-共轭二级抗体（绿色荧光）。细胞核用Hoechst 33342（蓝色荧光）进行复染。每组的代表性图片(n个=6）。比例尺25μm。箭头显示阳性染色细胞的例子。SREBP-1c阳性HSC在六个随机选择的高功率场中以200倍放大率计数，SREBP-1阳性HSC的计数如直方图所示。所有值均表示为平均值±SD*P（P）与第1组（TAA+Ad.Fc）或第3组（TAA+瘦素+Ad.Dkk-1）相比，<0.05。
图4
图4
ERK和p38 MAPK均介导瘦素诱导的培养HSC中β-连环蛋白的稳定。（A） β-catenin蛋白水平的Western blot分析。用瘦素刺激HSC 24小时，然后在有或无瘦素的情况下用5μM环己酰亚胺再处理24小时。结果是三个独立实验的代表。（B） 血清蛋白水平的Western blot分析9-磷酸化谷胱甘肽激酶-3β（p-GSK-3β）。用瘦素（100 ng·mL）刺激HSC−1)针对不同的时间段。总GSK-3β（T-GSK-3β）被用作内部控制。结果是三个独立实验的代表。（C） 血清蛋白水平的Western blot分析9-磷酸化谷胱甘肽激酶-3β（p-GSK-3β）和β-连环蛋白。在使用或不使用瘦素（100 ng·mL）刺激HSC之前，用或不使用PD98059（PD，MEK抑制剂，10μM）或SB203580（SB，p38 MAPK抑制剂，100μM）预处理HSC−1)额外30分钟（用于分析p-GSK-3β水平）或24小时（用于分析β-catenin水平）。总谷胱甘肽激酶-3β（T-GSK-3β）和β-肌动蛋白被用作各自的内部对照。结果是三个独立实验的代表。蛋白质条带的强度用密度计测定，印迹下的数字表明，在归一化为内部对照后，条带密度相对于相应对照（左侧第一条条带）的折叠变化*P（P）与单独使用瘦素的各样本相比，<0.05。（D） β-catenin活性的转染分析(n个= 6). 用β-catenin活性报告质粒pGL3-OT或pGL3-OF+pRL-TK转染HSC，然后用或不用PD98059（10μM）、SB203580（10μM）或瘦素（100 ng·mL）处理HSC−1)24 h。荧光素酶活性表示将pGL3-OT和pGL3-of归一化为内部对照pRL-TK活性后检测到的信号的比率。所有值均表示为平均值±SD*P（P）与未经治疗的相应对照组（左侧相应的第一列）相比<0.05。#P（P）与单独使用瘦素的样本相比，<0.05（左侧第二列）。
图5
图5
阻断β-catenin信号通路可减弱ERK和p38 MAPK对培养HSC中SREBP-1c启动子活性的抑制作用。（A，B）β-catenin的Western blot分析。每25cm用pMKK6E（A）、pcaMEK-1（B）或空载体转染HSC2烧瓶，用XAV939或载体处理24小时。三个独立实验显示了代表性。（C，D）转染分析SREBP-1c启动子活性(n个= 6). 每孔用固定量的DNA混合物（包括0.8μg pSREBP1c-Luc、0.3μg pMKK6E或0.3μg pcaMEK-1、30 ng pRL-TK和空载体）共同转染HSC，并用5μM XAV939或载体处理24小时计算用XAV939或载体处理的细胞。所有值均表示为平均值±SD*P（P）与单独使用载体的细胞相比，<0.05。使用空载体确保转染试验中的总DNA数量相等。
图6
图6
瘦素诱导的β-catenin信号通路抑制SREBP-1c的激活，但对培养的HSC的insogs、SCAP和LXRα没有影响。（A） 核活性形式SREBP-1c（nSREBP-1 c，68 kDa）蛋白质水平的Western blot分析。HSC在使用或不使用瘦素进行额外24小时治疗之前，用或不使用XAV939进行预处理。显示的代表性结果来自三个独立的实验。（B） 转染法分析SREBP-1c的反激活活性(n个= 6). 每孔用固定量的DNA混合物（包括0.8μg pSRE-Luc、不同剂量的pdncatenin（pdncat）、30 ng pRL-TK和空载体）共同转染HSC，并用或不用瘦素（ng·mL）处理−1)24 h。数值表示为平均值±SD*P（P）与仅使用瘦素的对照组相比，<0.05（左侧第一列）。（C，D，E）SCAP、insig-1、insig-2和LXRα的蛋白质水平的蛋白质印迹分析。用或不用瘦素（100 ng·mL）治疗HSC−1)不同时间段（C），或在使用或不使用瘦素（100 ng·mL−1)再延长24小时（D，E）。显示的代表性结果来自三个独立的实验。（F） 用于分析LXRα反激活活性的转染试验(n个= 6). 每孔用固定量的DNA混合物（包括0.8μg pLXRE-Luc、不同剂量的pdncatenin（pdncat）、30 ng pRL-TK和空载体）共同转染HSC，并用或不用瘦素处理（100 ng·mL−1)24 h。数值表示为平均值±SD*P（P）> 0.05,#P（P）与仅使用瘦素的对照组相比，<0.05（左侧第一列）。使用空载体确保转染试验中的总DNA数量相等。
图7
图7
瘦素通过β-catenin途径抑制SREBP1c的表达，导致培养的HSC中α-SMA和α1（I）胶原mRNA水平下降，β-catentin途径是TAA诱导肝损伤的ob/ob小鼠模型中瘦素诱导肝纤维化所必需的。（A） 实时PCR分析α-SMA和α1（I）胶原的mRNA水平。25 cm内的HSC2转染或不转染8μg质粒ptwist2（抑制SREBP1c活性）或空载体。HSC在含有脂肪分化鸡尾酒（MDI:0.5 mM IBMX，1μM地塞米松和1μM胰岛素）和0.4%FBS的DMEM中保存24 h后，切换到含有或不含有XAV939（5μM）的培养基中，并在含有或不含瘦素（100 ng·mL）的孵育前进行预处理−1)再持续24小时，通过实时PCR分析检测α-SMA和α1（I）胶原的mRNA水平(n个= 3). 数值表示为平均值±SD*P（P）与未经处理的细胞相比，<0.05（左侧对应的第一列）**P（P）与仅含瘦素的细胞相比，<0.05（左侧相应的第二列）。§P（P）与XAV939加瘦素的细胞相比，<0.05（左侧相应的第三列）。（B，C）评估肝纤维化和HSC激活。使用与图3相同的实验设计。Ob/Ob小鼠随机分为四组：第一组（TAA+Ad.Fc）、第二组（TAA+leptin+Ad.Fc）、第三组（TAA+leptin+Ad.Dkk-1）和第四组（TAA+Ad.Dkk-1）。在小鼠接受相应试剂4周后，通过肝切片胶原蛋白天狼星红染色检测肝纤维化，并通过α-SMA（箭头所示）的单荧光染色检测HSC激活，其中α-SMA的一级抗体和DyLight488-共轭二级抗体（B）或从各组中分离出HSC，并通过Western blot分析（C）直接用于检测α1（I）胶原、α-SMA和细胞周期蛋白D1的蛋白水平。每组的代表性图片(n个=6）。比例尺（左侧）80μm。比例尺（右侧）25μm。
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