MIR181A regulates starvation- and rapamycin-induced autophagy through targeting of ATG5

doi:10.4161/auto.23117

.2013年3月；9(3):374-85.

doi:10.4161/auto.23117。 Epub 2013年1月15日。

MIR181A通过靶向ATG5调节饥饿和雷帕霉素诱导的自噬

Kumsal Ayse Tekirdag公司¹, 戈兹德·科克马兹, 丹尼斯·古尔芬·奥斯图克, 鲁文·阿加米, Devrim Gozuacik公司

附属公司

PMID： 23322078
预防性维修识别码： PMC3590257型
内政部： 10.4161/自动23117

MIR181A通过靶向ATG5调节饥饿和雷帕霉素诱导的自噬

Kumsal Ayse Tekirdag公司等。自噬. 2013年3月.

.2013年3月；9(3):374-85.

doi:10.4161/auto.23117。 Epub 2013年1月15日。

作者

Kumsal Ayse Tekirdag公司¹, 戈兹德·科克马兹, 丹尼斯·古尔芬·奥斯图克, 鲁文·阿加米, Devrim Gozuacik公司

附属

¹土耳其伊斯坦布尔萨班奇大学工程与自然科学学院，生物科学与生物工程项目。

PMID： 23322078
预防性维修识别码： PMC3590257型
内政部： 10.4161/自动23117

摘要

大自噬（本文中的自噬）是一种细胞分解代谢机制，在包括饥饿、缺氧和错误折叠蛋白质积累在内的应激条件下激活。自噬异常与癌症和神经退行性疾病等病理学相关。因此，阐明控制自噬的信号通路至关重要。最近，我们和其他人将microRNAs（miRNAs）描述为自噬活性的新型有效调节剂。在此，我们将MIR181A（hsa-miR-181a-1）描述为一种新的自噬调节miRNA。我们发现，MIR181A的过度表达导致MCF-7、Huh-7和K562细胞中饥饿和雷帕霉素诱导的自噬性减弱。此外，抗坏血酸介导的内源性miRNA活性失活刺激了自噬。我们确定ATG5为MIR181A靶点。事实上，MIR181A过度表达后，细胞内ATG5细胞水平降低，而引入拮抗剂后，细胞中ATG5水平升高。更重要的是，在MIR181A存在的情况下，来自miRNA不敏感的cDNA构建体的ATG5的过表达挽救了自噬活性。我们还发现ATG5 3’UTR包含对点突变敏感的功能性MIR181A应答序列。因此，MIR181A是一种新的、重要的自噬调节因子，而ATG5是这种作用中的一个速率相关的miRNA靶点。

关键词：ATG5；MTOR；hsa-miR-181a；宏观自噬；哺乳动物自噬调节；微RNA；雷帕霉素；饥饿。

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数字

**图1。**的过度表达*MIR181A型*导致MCF-7细胞自噬活性降低。(A类)*MIR181A型*阻断饥饿诱导的MCF-7细胞GFP-LC3斑点形成。细胞与*MIR181A型*或控制结构(*反射镜*)与GFP-LC3质粒和自噬一起在无饥饿或饥饿（2小时）条件下进行评估。白色箭头表示细胞中的GFP-LC3点簇。(B类)定量分析（A）中的实验。*MIR181A型*过表达，但不控制(*MIR-CNT公司*)过度表达，阻断饥饿诱导的自噬（独立实验的平均值±SD，n=3，**p<0.01）。N.S.，不显著）。(C类)*MIR181A型*减少饥饿诱导MCF-7细胞LC3-I向LC3-II的转化。非供体（STV-）或饥饿（STV+）细胞提取物的免疫印迹结果（n=3）。标记LC3-II/LC3-I密度比。ACTB被用作加载控制。(D类)*MIR181A型*阻断饥饿诱导MCF-7细胞SQSTM1降解（n=3）。ACTB被用作加载控制。标记SQSTM1/ACTB的密度比。(E类)*MIR181A型*阻断雷帕霉素诱导的GFP-LC3斑点形成。细胞与GFP-LC3质粒共转染*MIR181A型*或*MIR-CNT公司*用二甲基亚砜（载体）或雷帕霉素（2.5µM，24小时）处理。(F类)（E）中实验的定量分析（独立实验的平均值±标准差，n=4，*p<0.05。N.S.，不显著）。(**G公司**)*MIR181A型*雷帕霉素（RAP）刺激MCF-7细胞（n=2）的LC3-I到LC3-II转换降低。标记LC3-II/LC3-I比率。(**H（H）**)*MIR181A型*阻断雷帕霉素诱导的MCF-7细胞SQSTM1降解（n=2）。

**图2。**的影响*MI181A公司*自噬不是细胞类型依赖性的。(A）*MIR181A型*阻断饥饿诱导的Huh-7细胞GFP-LC3斑点形成。细胞与GFP-LC3质粒共转染*MIR181A型*或*MIR-CNT公司*在无饥饿或饥饿（4h）条件下评估自噬。(B类)中实验的定量分析(A类)（独立实验的平均值±SD，n=3，*p<0.05）。N.S.，不显著）。(C类)*MIR181A型*表达降低了饥饿诱导的Huh-7细胞LC3-I到LC3-II的转化（n=3）。标记LC3-II/LC3-I比率。(D类)*MIR181A型*阻断饥饿诱导的Huh-7细胞SQSTM1降解（n=2）。标记SQSTM1/ACTB比率。(E类)*MIR181A型*阻断雷帕霉素诱导的GFP-LC3点形成。在DMSO或雷帕霉素治疗（2.5µM，24 h）后评估自噬。(F类)中实验的定量分析(E类)（独立实验的平均值±SD，n=3，**p<0.01。N.S.，不显著）。(**G公司**)*MIR181A型*导致雷帕霉素诱导的Huh-7细胞LC3-I向LC3-II的转化减少（n=2）。RAP，雷帕霉素。标记LC3-II/LC3-I比率。(**H（H）**)*MIR181A型*阻断雷帕霉素诱导的Huh-7细胞SQSTM1降解（n=2）。标记SQSTM1/ACTB比率。

**图3。**内源性抑制*MIR181A型*使用antagomirs（Ant-181a）刺激自噬活性。(A类)Ant-181a增强了饥饿诱导的GFP-LC3点的形成。CNT-Ant，对照抗菌素。(B类)中实验的定量分析(A类). 没有STV，没有饥饿。STV，饥饿20分钟（独立实验的平均值±SD，n=3，*p<0.05，**p<0.01）。(C类)Ant-181a，但不是CNT-Ant刺激的饥饿（STV，4 h）刺激MCF-7细胞中LC3-I到LC3-II的转换（n=4）。标记LC3-II/LC3-I密度比。(D类)Ant-181a，而非CNT-Ant导致MCF-7细胞（n=3）饥饿（4 h）后SQSTM1蛋白降解的刺激。标记SQSTM1/ACTB比率。

**图4。***MIR181A型*影响MCF-7细胞中的ATG5水平。(A类)*密尔181a*3′UTR中的目标序列*自动液位计5*mRNA。这个*MIR181A型*种子序列用斜体标记。(B类)ATG5蛋白水平在以下情况下降低*MIR181A型*MCF-7细胞中的过度表达。免疫印迹*MIR-CNT公司*或*MIR181A型*转染的细胞未被服务（STV-）或饥饿（STV+）（n=3）。ACTB被用作加载控制。显示了ATG5/ACTB波段密度比。(C类)定量PCR（qPCR）分析*自动液位计5*对照组mRNA水平*（MIR-CNT*)或*MIR181A型*转染MCF-7细胞（独立实验的平均值±SD，n=3，*p<0.05）。数据使用标准化*GAPDH公司*mRNA。(D类)Ant-181a转染后ATG5蛋白水平升高。CNT-Ant，对照antagomirs（n=2）。显示ATG5/ACTB比率。

**图5。**ATG5过度表达挽救了来自*MIR181A型*-介导的自噬抑制。MCF-7细胞与*MIR181A型*或*MIR-CNT公司*ATG5表达质粒缺乏*MIR181A型*目标区域。对自噬进行了评估。(A类)显示转染后ATG5和ACTB蛋白水平的免疫印迹分析（n=2）。显示ATG5/ACTB比率。(B类)饥饿前后（2小时）GFP-LC3斑点形成。ATG5，*MIR181A型-*不敏感的ATG5表达质粒。（C） GFP-LC3点形成的定量分析（独立实验的平均值±SD，n=3，**p<0.01和***p<0.001）。

**图6。**ATG5作为的直接目标*MIR181A型*和内源性变化*MIR181A型*细胞应激期间的水平。(A类)一种表示具有野生型（wt）或突变型3′UTR的荧光素酶构建物的方案*MIR181A型*的MRE序列*自动液位计5*。变异用小写字母标记并下划线。(B类)与野生型或突变型共转染的293T细胞裂解液中正常荧光素酶活性*自动液位计5*-荧光素酶构建物和*MIR181A型*或*MIR-CNT公司*（独立实验的平均值±SD，n=3，**p<0.01。N.S.，不显著）。(C类)内源性TaqMan定量PCR（qPCR）分析*MIR181A型*在控制（CNT，无饥饿）或饥饿（STV，2小时和4小时）条件下的水平。内源性*MIR181A型*水平对饥饿治疗没有反应（独立实验的平均值±SD，n=3，n.S.，不显著）。TaqMan qPCR数据使用*U6小型核1（RNU6-1）*（U6）mRNA水平。(D类)内源性TaqMan qPCR分析*MIR181A型*用二甲基亚砜（载体）或雷帕霉素处理的细胞中的水平。内源性*MIR181A型*雷帕霉素治疗后水平升高（独立实验的平均值±标准差，n=4，*p<0.05）。

**图7。**描述*MIR181A型*自噬途径。*MIR181A型*通过靶向关键自噬蛋白ATG5调节应激诱导的自噬。由此导致的ATG12–ATG5-ATG16L1活性降低导致LC3脂质氧化减弱，并抑制膜伸长和自噬完成阶段。

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