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.2013年2月14日；494(7436):256-60.
doi:10.1038/nature11808。 Epub 2013年1月6日。

双胍类化合物通过减少环腺苷酸的产生抑制肝胰高血糖素信号

拉塞尔·米勒 1, 清威楚, 谢建新, 马克·福雷茨, 贝诺伊特·维奥利特, 莫里斯·J·伯恩鲍姆
附属公司

双胍类化合物通过减少环腺苷酸的产生抑制肝胰高血糖素信号

罗素·A·米勒等。 自然. .

摘要

肝脏的葡萄糖生成对于在禁食期间为大脑提供底物至关重要。胰岛素不能抑制肝葡萄糖输出是2型糖尿病高血糖和其他胰岛素抵抗疾病的主要病因。五十年来，双胍类药物一直是为数不多的有效降低血糖生成的治疗药物之一，其中包括二甲双胍和二甲双胍，后者是治疗2型糖尿病最常用的药物。尽管如此，双胍类药物的作用机制仍不清楚。十年前，二甲双胍通过激活AMP-activated protein kinase（AMPK）酶来减少葡萄糖合成的说法最近受到了基因功能丧失实验的挑战。在此，我们提供了一种新的机制，二甲双胍通过这种机制拮抗胰高血糖素的作用，从而降低空腹血糖水平。在小鼠肝细胞中，二甲双胍导致AMP和相关核苷酸的积累，这些核苷酸抑制腺苷酸环化酶，降低环AMP和蛋白激酶A（PKA）活性水平，消除PKA关键蛋白靶点的磷酸化，并阻断肝细胞的胰高血糖素依赖性葡萄糖输出。这些数据支持二甲双胍的作用机制，包括拮抗胰高血糖素，并建议开发抗糖尿病药物的途径。

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数字

图1
图1。双胍类化合物抑制cAMP生成
答：。将原代肝细胞与指定浓度的二甲双胍孵育2小时，5 nM胰高血糖素孵育15分钟，裂解并分析细胞总cAMP和蛋白质。每个点N=4。B。将原代肝细胞与指定浓度的二甲双胍孵育2小时，然后用高氯酸和用HPLC定量的细胞核苷酸提取。每个点N=4。C–D。原代肝细胞与指定浓度的二甲双胍孵育(C类)或二甲双胍(天)24小时，用5 nM胰高血糖素处理，溶解并分析细胞总cAMP。每个点N=4。E.公司。将原代肝细胞与指定浓度的二甲双胍孵育2小时，用5 nM胰高血糖素处理，裂解，并测定PKA激酶活性。0μM和1000μM苯乙双胍组N=6，100μM和300μM苯乙双胍组N=4。F、。将原代肝细胞与二甲双胍孵育2小时，然后用胰高血糖素，用磷酸-PKA底物基序抗体、总和磷酸-PFKFB1抗体以及总和磷酸IP3R抗体通过western blot分析蛋白质。误差条表示标准误差。
图2
图2。双胍类药物抑制胰高血糖素信号传导
A–B类。原代肝细胞在65μM二甲双胍存在或不存在的情况下培养18小时，在指定浓度的胰高血糖素下培养15分钟(A类)或细胞渗透性PKA激动剂SP-8Br-cAMPS-AM(B类). 全磷酸化PFKFB1、CREB、IP3R和AMPK的蛋白质印迹分析。E.公司。用指定浓度的二甲双胍和1 nM胰高血糖素或3μM SP-8Br-cAMPS-AM处理细胞14小时，然后测量5小时的葡萄糖输出量。数据表示三个实验的平均值，每个实验N=6。误差条表示标准误差。
图3
图3。双胍对cAMP生成的影响机制
答：。 AMPKα1液氧/液氧/α2液氧/液氧小鼠感染AAV-TBG-GFP或AAV-TBC-Cre病毒，14天后分离原代肝细胞。用指定浓度的二甲双胍处理细胞2小时，然后用5 nM胰高血糖素处理15分钟。答：。通过western blot分析总细胞蛋白，以检测总和磷酸化T172 AMPK以及总和磷酸-S79 ACC。B。肝细胞被裂解，细胞总cAMP水平通过ELISA定量。所有点N=4。C、。原代肝细胞与指定浓度的二甲双胍孵育2小时，50μM RO-20-1724（PDE4i）孵育最后30分钟。然后用5 nM胰高血糖素处理细胞15分钟，进行裂解，并测定细胞总cAMP。所有点的N=4。D。通过差速离心分离出原代肝细胞的膜部分，并用于在AMP和ATP浓度、100 nM胰高血糖素和100μM GTP存在的情况下测定腺苷酸环化酶活性。所有点N=6。误差条表示标准误差。
图4
图4。双胍类拮抗体内胰高血糖素信号
答：。用500 mg/kg二甲双胍灌胃小鼠，1小时后腹腔注射200μg/kg胰高血糖素，并在指示时间N=6（水/pbs和二甲双胍/胰高血糖激素）、N=7（水/胰高糖素和二甲双酮/pbs）测量血糖水平。B–C类。喂食的小鼠禁食1小时，并用水或500毫克/千克体重的二甲双胍灌胃。一小时后，向小鼠腹腔内注射2 mg/kg胰高血糖素，五分钟后收集肝组织。对肝脏进行分析B。ELISA测定的总肝cAMP（每组N=3）和C、。肝脏PKA总活性（水/pbs、水/胰高血糖素、二甲双胍/pbs、二甲双酮/胰高糖素分别为N=7、8、6、7）。D–F。将禁食18小时的小鼠灌胃给水或250 mg/kg二甲双胍，1小时后收集肝组织，用高氯酸和全肝提取肝代谢物(D.）AMP和(E.）测定cAMP水平。水和二甲双胍组N=12和9。G–I。喂食高脂肪饮食10周的小鼠隔夜禁食，灌胃水或250 mg/kg二甲双胍，1小时后收集肝组织进行Western blot分析(G.）AMPK、，（高）PFKFB1和（一）IP3R。每组N=3。误差条表示标准误差。
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