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.2013年3月；9(3):361-73.
doi:10.4161/auto.23066。 Epub 2013年1月4日。

非协调51样激酶1和2对营养素敏感自噬的调节

菲奥娜·麦克阿尔宾 1, 利昂·威廉姆森, 莎伦·A·图兹, Edmond Y W Chan先生
附属公司

非协调51样激酶1和2对营养素敏感性自噬的调节

菲奥娜·麦克阿尔宾等。 自噬. 2013年3月.

摘要

大自噬，通常被称为自噬（autophagy），是一种蛋白质降解途径，在细胞中组成性发生，但也可能由营养缺乏或蛋白质聚集等应激因素诱导。自噬与多种疾病机制有关，包括神经变性和癌症，具有抑癌和致癌作用。非协调51样激酶1（Uncoordinated 51 like kinase 1，ULK1）是一种重要的自噬蛋白，位于层级调控通路的顶点附近，接收来自主营养传感器MTOR和AMP-activated protein kinase（AMPK）的信号。在哺乳动物中，ULK1有一个密切的同源物ULK2，尽管它们的功能区别尚不清楚。在这里，我们表明ULK1和ULK2都支持营养素饥饿后的自噬激活。只有在小鼠胚胎成纤维细胞中ULK1和ULK2的联合缺失时，氨基酸或葡萄糖饥饿后增加的自噬才会被破坏。联合Ulk1/2双敲除阻断了氨基酸饥饿后PtdIns3P的生成和WIPI2或ZFYVE1/DFCP1向吞噬细胞的招募。葡萄糖饥饿后的自噬激活并不涉及WIPI1或WIPI2的募集以形成自噬体。与PtdIns3P非依赖性机制一致，葡萄糖依赖性自噬对沃特曼宁具有耐药性。我们的研究结果支持ULK1和ULK2在营养依赖性自噬激活方面的功能冗余，并进一步强调了对氨基酸和葡萄糖缺乏反应的差异途径。

关键词：MEF；ULK1；ULK2；WIPI1；WIPI2；淘汰赛；营养缺乏。

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数字

无
图1。在氨基酸饥饿后，ULK1和ULK2的缺失会抑制自噬。(A类)野生型（WT），乌尔克1敲除（ULK1KO），Ulk2公司击倒（ULK2KO）和两个独立推导的乌尔克1/Ulk2公司用含50nM巴非霉素A的全营养培养基（F）、EBSS（-AA）或EBSS处理双敲除（DKO）MEF株系1（Baf）2 h。用针对ULK1、肌动蛋白和LC3（纳米工具5F10单克隆）的抗体对溶解的细胞裂解物进行免疫印迹。“*”表示ULK1免疫印迹上的非特异性带。用SV40 T抗原永生化MEF株。下图：LC3-II/LC3-I信号用2种不同的y轴标度绘制为平均值±SEM（n=4）。在相同条件下，对WT MEF值进行双尾配对t检验：*p<0.04**p<0.005；一p=0.14；b条p=0.056；c（c）p=0.12。(B类)从MEF株系中提取总RNA，如(A类)并分析了乌尔克1和Ulk2公司转录水平使用定量RT-PCR。绘图显示乌尔克1或Ulk2公司标准化为的级别肌动蛋白转录水平（平均±SEM，（n=3），与WT细胞相关的值）。(C类)WT和DKO MEF线被视为(A类)用磷酸化-（Ser79）乙酰辅酶A羧化酶（P-ACC）、磷酸化-核糖体蛋白S6（P-RPS6）抗体对溶解的细胞裂解物进行免疫印迹；肌动蛋白和LC3（5F10单克隆抗体）。(D类)在裂解和免疫印迹分析之前，将MEF系置于全营养培养基（F）或葡萄糖饥饿（−Glc）中16 h，如(C类). (E类)用C14缬氨酸稳态标记MEF系过夜，追踪24小时，并分析氨基酸饥饿2小时内的蛋白质降解情况。图中显示了平均±SEM（n=3）。对WT MEF进行双尾配对t检验：*p<0.02**p＜0.01。(F类)WT和乌尔克DKO#1 MEF被视为(A类)固定2h，进行LC3免疫染色。所示为−AA和−AA+Baf条件的典型共焦图像。比例尺：10μm。图中显示了平均点/细胞±SEM（每列：两个实验中每种条件下的n=22至39个细胞）。在相同条件下与WT MEF比较时的双尾配对t检验：***p<0.0003*p<0.02。(G公司)初级WT和DKO MEF处于饥饿状态，如(A类)并裂解用于SQSTM1和肌动蛋白的免疫印迹分析。右：绘图密度测定法[SQSTM1水平归一化为肌动蛋白，显示为平均值±SEM（n=4）]。在相同条件下与WT MEFs比较时的双尾配对t检验：*p<0.04，**p<0.01。
无
图2。ULK1和ULK2都是在氨基酸饥饿后形成WIPI2斑点所必需的。(A类)WT、ULK1KO、ULK2KO和DKO原发性MEF在固定前用全营养培养基（F）或EBSS（−AA）处理2 h。然后用WIPI2抗体对细胞进行染色。(B类)在每种情况下的10个字段中（两个独立实验），对Hoechst染色的细胞核（细胞数）和WIPI2点进行量化（WIPI2点状/细胞±SEM）（n=20个字段）。F和−AA之间的差异通过使用Bonferroni事后检验的单向ANOVA表示为*****p<0.0001，无显著性差异。(C类)主要MEF系按(A类). 对细胞裂解物进行ULK1、WIPI1、WIPI2和肌动蛋白的免疫印迹。(D类)将稳定表达GFP-ZFYVE1的WT和DKO#1永生化细胞置于全营养培养基（F）或EBSS（−AA）中培养2h，然后固定。(A和D)比例尺：10μm。图中显示了点状/细胞（两个实验中每个条件下n=29到37个细胞的平均±SEM）。在相同条件下，与WT MEF相比的双尾配对t检验：***p<0.0001。
无
图3。ATG13击倒现象乌尔克1/Ulk2公司氨基酸饥饿后LC3脂质代谢途径的双重敲除。(A类)用RISC-Free对照或小鼠转染WT和DKO原代MEF附件13-靶向siRNA。敲除后，用全营养培养基（F）、EBSS（−AA）或含有巴非霉素A的EBSS处理细胞1（−AA+Baf）（100 nM）2 h。用针对ULK1、ATG13、肌动蛋白和LC3（Abcam多克隆）的抗体对溶解的细胞裂解物进行免疫印迹。(B类)平均LC3-II/肌动蛋白密度测定±SEM（n=4）。在相同条件下，相对于WT RISC游离siRNA MEFs进行双尾配对t检验：一p=0.067；b条p=0.068；c（c）p=0.089。
无
图4。ATG13击倒现象乌尔克1/Ulk2公司氨基酸饥饿后WIPI2-阳性自噬体膜形成的双重敲除。WT、ULK1KO、ULK2KO和DKO主要MEF通过RISC-Free对照或小鼠转染附件13-靶向siRNA。敲除后，细胞在固定前用全营养培养基（F）或EBSS（−AA）处理2小时。用针对WIPI2的抗体对细胞进行染色。比例尺：10μm。
无
图5。组合乌尔克1和Ulk2公司敲除降低LC3对葡萄糖饥饿的脂质代谢反应。(A类)将WT或DKO初级MEF处理为全营养培养基（F）、无葡萄糖条件（−Glc）或无葡萄糖培养基+巴非霉素A1（−Glc+Baf）（100 nM）持续24 h。用ULK1、肌动蛋白和LC3（Abcam多克隆）抗体对溶解的细胞裂解物进行免疫印迹。“*”表示非特异性带。(B类)用密度计定量LC3-II和肌动蛋白信号。结果显示为平均值±SEM（n=4）。在相同治疗下，对WT MEF进行双尾配对t检验：*p<0.02。
无
图6。葡萄糖饥饿不会刺激含有WIPI2的膜的生成。WT、ULK1KO、ULK2KO和DKO初级MEF用全营养培养基（Fed）或无葡萄糖培养基（葡萄糖饥饿）处理24 h，然后固定。用WIPI2抗体对细胞进行染色。比例尺：10μm。
无
图7。葡萄糖饥饿后LC3脂质化和自噬体形成是PtdIns3P非依赖性的。(A类)将WT初级MEF用含有100 nM沃特曼（−AA+Wm）的全营养培养基（F）、EBSS（−AA）或EBSS处理2 h。或者，将细胞在无葡萄糖培养基（−Glc）或含有100 nM沃特曼的无葡萄糖培养液中培养24 h。用LC3（Abcam多克隆）和肌动蛋白抗体对溶解的细胞裂解物进行免疫印迹。结果显示为平均LC3-II/actin±SEM（n=4）。在不含沃特曼的等效治疗条件下进行双尾配对t检验：*p<0.04。(B类)用全营养培养基（F）或EBSS（−AA）处理WT（永生化）MEF 2 h。或者，将细胞在无葡萄糖培养基（−Glc）中培养16 h。如有指示，培养包括100 nM沃特曼（+Wm）。细胞经LC3免疫染色处理后固定。所示为−AA和−Glc条件±沃特曼的典型共焦图像。比例尺：10μm。图中显示了每个条件的点状/单元分布。每列代表一个细胞的定量（40-60个细胞/条件取自两个实验）。所示为每组中包含15个（或更多）点/单元格的单元格百分比。
无
图8。葡萄糖饥饿后无WIPI1-和WIPI2-阳性自噬体膜。WT初级MEF在全营养培养基（Fed）、EBSS（−AA）或含有100 nM沃特曼（−AA+Wm）的EBSS中培养2小时。或者，在固定之前，细胞在没有或含有100 nM沃特曼宁（−Glc，−Glc+Wm。用WIPI2（红色）和WIPI1（绿色）抗体对细胞进行染色。比例尺：10μm。放大的插图显示了氨基酸饥饿后的WIPI2和WIPI1共定位（箭头：强共定位；箭头：部分）。
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  • 能量代谢和自噬的相互作用。
    冯毅、陈毅、吴旭、陈杰、周强、刘斌、张磊、易C。 冯毅等。 自噬。2024年1月；20(1):4-14. doi:10.1080/15548627.2023.2247300。Epub 2023年8月18日。 自噬。2024 PMID：37594406 审查。
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    1. Tooze SA、Jefferies HB、Kalie E、Longatti A、McAlpine FE、McKnight NC等。哺乳动物自噬中的贩运和信号传递。IUBMB寿命。2010;62:503–8. doi:10.1002/iub.334。-内政部-公共医学
    1. Orsi A、Polson HE、Tooze SA。参与自噬的膜贩运事件。当前操作细胞生物学。2010;22:150–6. doi:10.1016/j.ceb.2009.11.013。-内政部-公共医学
    1. Mizushima N，Yoshimori T，Ohsumi Y。Atg蛋白在自噬体形成中的作用。年收入细胞开发生物。2011年；27:107–32. doi:10.1146/annurev-cellbio-092910-154005。-内政部-公共医学
    1. Yan J，Kuroyanagi H，Kuroiwa A，Matsuda Y，Tokumitsu H，Tomoda T，等。小鼠ULK1的鉴定，ULK1是一种与秀丽线虫UNC-51结构相关的新型蛋白激酶。生物化学与生物物理研究委员会。1998年；246:222–7. doi:10.1006/bbrc.1998.8546。-内政部-公共医学
    1. Kuroyanagi H、Yan J、Seki N、Yamanouchi Y、Suzuki Y、Takano T等。人类ULK1，一种与秀丽隐杆线虫UNC-51激酶相关的新型丝氨酸/苏氨酸激酶：cDNA克隆、表达和染色体分配。基因组学。1998年；51:76–85. doi:10.1006/geno.1998.5340。-内政部-公共医学

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