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.2013年2月15日；339(6121):786-91.
doi:10.1126/science.1232458。 Epub 2012年12月20日。

环GMP-AMP合成酶是一种激活I型干扰素途径的细胞溶质DNA传感器

孙丽君 1, 吴嘉熙, 丰河渡, 向晨, Zhijian J Chen先生
附属机构

环GMP-AMP合成酶是一种激活I型干扰素途径的细胞溶质DNA传感器

孙丽君等。 科学. .

摘要

哺乳动物细胞细胞质中DNA的存在是一个危险信号，它会触发宿主免疫反应，例如产生I型干扰素。胞质DNA通过产生环状鸟苷单磷酸腺苷单磷酸（环状GMP-AMP，或cGAMP）诱导干扰素，后者结合并激活衔接蛋白STING。通过生化分馏和定量质谱，我们鉴定了一个cGAMP合成酶（cGAS），它属于核苷酸转移酶家族。cGAS的过度表达激活转录因子IRF3并以STING依赖的方式诱导干扰素-β。cGAS基因敲除通过DNA转染或DNA病毒感染抑制IRF3激活和干扰素-β诱导。cGAS与细胞质中的DNA结合并催化cGAMP合成。这些结果表明，cGAS是一种细胞溶质DNA传感器，通过产生第二信使cGAMP诱导干扰素。

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数字

图1
图1。一种cGAMP合成酶（cGAS）的鉴定
(A类)使用PROMALS3D程序对小鼠cGAS、人类cGAS和人类OAS1的假定核苷酸转移酶（NTase）域进行多序列和结构比对。NTase超家族的保守活性位点残基以黑色突出显示，相同氨基酸以红色突出显示，保守氨基酸以黄色突出显示。预测的二级结构在线形上方显示为α螺旋（H）和β链（E）。(B和C)不同小鼠cGAS RNA水平的定量RT-PCR分析(B类)和人类(C类)细胞系。MEF（imt）：永生MEF；原始：原始264.7；SDM：脾源性巨噬细胞；BMDM：骨髓源性巨噬细胞。本次和所有其他q-RT-PCR分析中的误差条代表平均值的标准误差（n=3）。(D类)用所示抗体对HEK293T和THP1细胞中的内源性人类蛋白进行免疫印迹。
图2
图2。cGAS激活IRF3并诱导IFNβ
(A类)将编码标记小鼠cGAS（m-cGAS）及其活性位点突变体G198A/S199A（GS>AA）和MAVS的表达质粒（100和500 ng）转染到HEK293T细胞或稳定表达STING的同一细胞系（HEK293 T-STING）。转染24小时后，用q-RT-PCR检测IFNβRNA。(B类)与（A）类似，只是通过天然凝胶电泳分析细胞裂解物的IRF3二聚体（顶部）。用Flag抗体免疫印迹法监测转染基因的表达水平（底部）。h-cGAS：人体cGAS；小鼠cGAS中的ED>AA:E211A/D213A。(C类)将所示蛋白的表达载体转染到HEK293T-STING细胞中，然后通过q-RT-PCR测量IFNβ。(D类)在SDS-PAGE和天然PAGE后，分别用Flag和IRF3抗体对（C）中显示的细胞裂解物进行免疫印迹（顶部两个面板）。对等分的细胞提取物进行cGAMP活性检测，这是通过检测IRF3二聚化在输送到渗透性Raw264.7细胞（底部）后进行测量的。(E类)人和小鼠cGAS在HEK293T细胞中表达，并使用Flag抗体纯化亲和力。在存在或不存在HT-DNA的情况下，将蛋白质与ATP和GTP孵育，并通过cGAMP在Raw264.7细胞中诱导IRF3二聚体的能力来评估cGAMP的合成。
图3
图3。cGAS对于通过DNA转染和DNA病毒感染激活IRF3和诱导IFNβ至关重要
(A类)将稳定表达靶向GFP（对照）或m-cGAS两个不同区域shRNA的L929细胞株用HT-DNA转染指定时间，然后用q-RT-PCR检测IFNβRNA。RNAi效率见图S4B。(B类)将稳定表达抗GFP、cGAS或STING shRNA的L929细胞转染pcDNA3（载体）或驱动指示蛋白表达的相同载体。转染24小时后，用q-RT-PCR检测IFNβRNA。RNAi效率见图S4C。(C类)如图所示，将cGAMP（100 nM）输送至洋地黄素透性化L929/shRNA细胞。在cGAMP给药后的指定时间，用q-RT-PCR测定干扰素βRNA。(D类和E类)将所示L929-shRNA细胞感染HSV1（ΔICP34.5）或仙台病毒（SeV）达所示时间，然后测量IRF3二聚体。(F类)用HT-DNA转染L929/shRNA细胞或用HSV1感染6小时，然后测量IRF3二聚化（顶部）。这些细胞的提取物被用于制备耐热上清液，这些上清液被输送到渗透性Raw264.7细胞，以刺激IRF3二聚化（底部）。(克)使用C18柱通过HPLC对（F）中的耐热上清液进行分级，并使用SRM通过质谱测定cGAMP的丰度。
图4
图4。纯化cGAS依赖DNA合成cGAMP
(A类)从HEK293T细胞表达和纯化的Flag-h-cGAS的银染。(B类)如（A）所示，在存在不同形式核酸的情况下，用ATP和GTP培养纯化的Flag-h-cGAS。cGAMP的生成通过其在Raw264.7细胞中诱导IRF3二聚体的能力进行评估。(C类)类似于（B），不同之处在于反应含有HT-DNA和NTP的不同组合。(D类)与（B）类似，除了WT和突变cGAS蛋白是从大肠杆菌并对其在指定浓度下的活性进行分析。(E类)净化的m-cGAS来自大肠杆菌与ATP、GTP和DNA孵育0或60 min，通过IRF3二聚化分析（顶部）和SRM质谱（底部）分析cGAMP的产生。
图5
图5。cGAS是一种DNA结合蛋白
(A类)显示的GST融合蛋白表达并纯化自大肠杆菌然后在ISD或生物素ISD存在下与链霉亲和素珠培养。结合蛋白用SDS样品缓冲液洗脱，并用GST抗体进行免疫印迹检测。(B类)从HEK293T细胞中表达并纯化Flag-h-cGAS，然后用链霉亲和素珠培养，如（A）所述，但Flag抗体用于免疫印迹，生物素RNA也用于与cGAS结合。(C类)在HEK293T细胞中表达标记的全长或截短人cGAS蛋白，并纯化亲和力。如（B）所述，对其结合生物素ISD的能力进行了分析。右图：将编码h-cGAS全长和缺失突变体的表达质粒转染到HEK293T-STING细胞，然后通过q-RT-PCR测量IFNβRNA。
图6
图6。cGAS与细胞质中的DNA结合
(A类)从THP-1细胞制备细胞核和细胞质部分，并用所示抗体进行免疫印迹分析。(B类)THP-1细胞在低渗缓冲液中均质并进行差速离心。用所示抗体对不同离心速度的颗粒（例如P100：100000×g后的颗粒）和S100进行免疫印迹。(C类)用Cy3-ISD（红色）转染稳定表达Flag-cGAS（绿色）的L929细胞。在转染后的不同时间点，固定细胞，用Flag抗体或DAPI染色，并通过共聚焦荧光显微镜成像。插入：合并图像中轮廓区域的放大。这些图像代表每个时间点至少10个细胞（代表>50%的受检细胞）。
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中的注释

  • 免疫学。感知DNA的黑暗面。
    O'Neill洛杉矶。 奥尼尔洛杉矶。 科学。2013年2月15日；339(6121):763-4. doi:10.1126/science.1234724。 科学。2013 PMID：23413341 没有可用的摘要。

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