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.2013年3月；12(3):587-98.
doi:10.1074/mcp。M112.021303。 Epub 2012年12月10日。

LIM1863结肠癌细胞衍生类有机物释放出两种不同的外泌体

弓J陶罗 1, 大卫·W·格林, 隆美尔·马蒂亚斯, 苏雷什·马蒂瓦南, Hong Ji公司, 理查德·辛普森
附属机构

LIM1863结肠癌细胞衍生类有机物释放出两种不同的外泌体

弓J陶罗等人。 分子细胞蛋白质组学. 2013年3月.

摘要

外显体是由内吞起源的天然生物纳米膜囊泡（～40至100 nm），从不同类型的细胞释放到细胞外空间。它们具有多效性功能，如抗原提呈和蛋白质货物、mRNA、microRNA、脂质的细胞间转移，以及致癌潜力。在这里，我们描述了通过使用抗A33和抗EpCAM偶联磁珠的顺序免疫捕获，从人结肠癌细胞系LIM1863的类器官中释放出的两个不同的外显体群体的分离。外显子群体（A33-Exos和EpCAM-Exos）无法通过电子显微镜进行区分，并且包含典型的外显子标记，如TSG101、Alix和HSP70。通过基于凝胶的LC-MS/MS揭示的这项研究的显著发现是在EpCAM-Exos中唯一鉴定出经典的心尖转运分子CD63（LAMP3），粘蛋白13和顶端肠酶蔗糖酶异麦芽糖酶，增加二肽基肽酶IV和顶端限制性五跨膜糖蛋白prominin 1的表达。相反，A33-Exos制剂富含基底外侧转运分子，如早期内体抗原1、高尔基体膜蛋白ADP-核糖基化因子和网格蛋白。我们的观察结果与EpCAM-和A33-Exo分别从顶端和基底外侧表面释放的结果一致，和EpCAM-Exos蛋白质组剖面，以及广泛发布的定型外显子。为了明确区分A33-和EpCAM-Exos与sMVs，还对LIM1863衍生的小棚微泡（sMVs）进行了蛋白质组分析。有趣的是，抗原呈递分子的MHC I类家族的几个成员仅在A33外显子中观察到，而在EpCAM外显子中通过MS既没有观察到MHC I类分子也没有观察到MHC II类分子。此外，我们首次在任何细胞外囊泡研究中报告了EpCAM、claudin-7和CD44在EpCAM-Exos中的共定位。鉴于已知这些分子复合在一起可促进肿瘤进展，对胞外体亚群的进一步表征将有助于更深入地了解其在肿瘤微环境调节中的可能作用。

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数字

图1。
图1。
从结肠癌细胞系LIM1863中分离出外泌体和脱落微泡。LIM1863细胞在无血清培养基中培养24小时，补充胰岛素-转铁蛋白-硒，然后收集CM。首先通过差速离心法从CM中分离出棚状微泡（sMVs）。然后过滤上清液（0.1μm），并通过5K标称分子量限制膜通过离心超滤进行浓缩。通过抗A33抗体免疫捕获从CCM中分离出A33阳性外泌体（A33Exos）。通过使用载EpCAM的磁珠进行免疫捕获，从A33-外显子缺失的CCM中分离出EpCAM-Exos。
图2。
图2。
LIM1863细胞衍生A33-和EpCAM-Exos的形态特征和蛋白质组分析。 A类，A33-和EpCAM-Exos的电子显微照片，用乙酸铀酰负染，并在200 kV下进行检查；比例尺=100 nm。B类Alix（PDCD6IP）、TSG101、A33和EpCAM的A33-Exos、未结合材料（通过抗A33抗体捕获珠）和EpCAM-Exos（每车道10μg）的Western blot分析。C类，双向维恩图，描绘了来自A33-和EpCAM-Exos的外体蛋白的重叠。684个蛋白质在两个外体数据集中都是通用的，340个和214个蛋白质分别是A33-和EpCAM-Exos所特有的。
图3。
图3。
通过制备LIM1863类有机物的共焦光学部分。将LIM1863细胞与小鼠抗A33抗原IgG和兔抗EpCAM抗原IgC（1μg/ml）孵育，然后与Alexa Fluor®546结合的山羊抗兔IgG以及Alexa Fluor®488结合的山羊抗鼠IgG二级抗体（1:200）孵养。A33抗原（绿色）分布于基底外侧细胞外周，EpCAM抗原分布于顶环（红色）。比例尺，30μm。
图4。
图4。
描述LIM1863衍生外泌体的两个离散群体的分子结构的模型。在顶端外体（EpCAM-Exos）和基底外侧外体（A33-Exos）中表达的选定蛋白包括外体标记蛋白（Alix、TSG101、HSP70和CD9）、整合素（ITGA2、ITGAV、ITGA6和ITGB6）、肾上腺素受体（EPHB1、-B2、-B3、-B4、-A2、-A5、-A6和-A7）、四spanin蛋白（TSPAN8、TSAN14、TSPAN15和CD81），以及四spanin-like claudin蛋白（CLDN3、CLDN4和CLDN15）。有关A33-和EpCAM-Exos中普遍表达的蛋白质的详细列表，请参见补充表S1顶端外泌体还包含（i）四spanin蛋白（CD63、TSPAN3和TSPAN6）和四spanin样克劳丁7（CLDN7），（ii）顶端定位的蔗糖酶异麦芽糖酶（SI）和粘蛋白13（MUC13），（iii）补体介导的裂解抑制剂（CD46、CD59），以及（iv）先天免疫反应高迁移率族蛋白盒（HMGB2、HMGB3）。顶端外泌体包含EpCAM、CLDN7和CD44，据报道它们共同复合以介导肿瘤进展。基底外侧外泌体包含早期内体抗原1（EEA1）、RAB13和基底外侧分选蛋白（网格蛋白CLTA和CLTB；网格蛋白适配器蛋白AP1G1、AP1M1、AP1M2和AP3B1；共构体亚基COPB2；和ADP-核糖基化因子1）。基底外侧外泌体还包含细胞膜跨膜蛋白结肠特异性抗原GPA33、钙调素1（CLSTN1）、受体辅助蛋白6（REEP6）和MHC I类分子（HLA-A、-B、-C、-E和-A29.1）。
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