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.2013年4月；62（4）：1270-81。
doi:10.2337/db12-0533。 Epub 2012年12月7日。

活化AMPK分解Bcl-2-Beclin1复合物增强糖尿病患者心脏自噬并防止心肌细胞凋亡

何朝勇 1, 朱怀平, 李洪亮, 邹明辉, 谢忠林
附属机构

活化AMPK分解Bcl-2-Beclin1复合物增强糖尿病患者心脏自噬并防止心肌细胞凋亡

何朝勇等人。 糖尿病. 2013年4月.

摘要

糖尿病心肌病与抑制心脏自噬有关，激活AMP-activated protein kinase（AMPK）可恢复糖尿病小鼠的心脏自吞噬并预防心肌病，尽管机制尚不清楚。我们假设AMPK诱导的自噬通过抑制心肌细胞凋亡改善糖尿病心肌病，并在糖尿病小鼠和高葡萄糖处理的H9c2心肌成肌细胞中检测AMPK对Beclin1和Bcl-2之间相互作用的影响，Bcl-2是自噬和凋亡之间的转换。H9c2细胞暴露于高糖降低AMPK活性，抑制Jun NH2末端激酶1（JNK1）-B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）信号传导，并促进Beclin1与Bcl-2的结合。相反，二甲双胍激活AMPK可刺激JNK1-Bcl-2信号传导，并破坏Beclin1-Bcl-2复合物。AMPK的激活使心脏自噬正常化，减弱了高糖诱导的培养H9c2细胞凋亡。这种作用通过抑制自噬而减弱。最后，糖尿病小鼠长期服用二甲双胍，通过激活JNK1-Bcl-2通路并分离Beclin1和Bcl-2，恢复了心脏自噬。自噬的诱导可防止糖尿病小鼠心脏细胞凋亡，改善心脏结构和功能。我们的结论是，Bcl-2与Beclin1的分离可能是通过AMPK激活预防糖尿病心肌病的重要机制，AMPK活化可恢复自噬并保护心肌细胞凋亡。

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数字

图1。
图1。
激活AMPK可防止H9c2细胞中高糖（HG）对自噬的抑制。A类：用不同浓度的葡萄糖处理H9c2细胞48小时，用抗LC3B抗体通过Western blot分析细胞裂解物(n个= 6; *P（P）<0.05，†P（P）与对照组相比<0.01（续）。B类：H9c2细胞暴露于HG（30 mmol/L）指定时间，并通过Western blotting检测细胞裂解液中的LC3-II蛋白水平(n个= 6; *P（P）<0.05与Con）。C类：H9c2细胞在存在或不存在CQ（5μmol/L）的情况下用HG处理48小时，并通过蛋白质印迹测定细胞裂解物中LC3-II的表达(n个=5*P（P）<0.05与对照组，†P（P）与CQ相比<0.05）。D类和E类用编码GFP-LC3的腺病毒感染H9c2细胞24小时。然后用HG、CQ（5μmol/L）或HG加CQ处理细胞48小时。用倒置荧光显微镜检测GFP-LC3。D类：GFP-LC3染色的代表性显微摄影。E类：通过计数细胞中的GFP-LC3点来量化自噬(n个=5*P（P）<0.05与对照组，†P（P）与CQ相比<0.05）。F类：用HG、二甲双胍（Met；1 mmol/L）、HG加Met或HG/Met/CQ处理H9c2细胞48小时。使用P-AMPK（Thr172）、P-ACC（Ser79）和LC3B抗体通过Western blot分析细胞裂解物(n个=5*P（P）<0.05与对照组，†P（P）<0.05 vs.HG，P（P）<0.05 vs.HG/Met）。G公司和小时：转染GFP-LC3的H9c2细胞用HG、Met、HG+Met或HG/Met/CQ处理48小时。用倒置荧光显微镜检测GFP-LC3。G公司：GFP-LC3染色的代表性显微摄影。小时：通过计数细胞中的GFP-LC3点来量化自噬(n个=5*P（P）<0.05与对照组，†P（P）<0.05 vs.HG，P（P）<0.05 vs.HG/Met）。我：用对照siRNA（C-siRNA）或AMPK-siRNA（AMPK-si）转染H9c2细胞48小时。细胞在HG培养基中孵育，用或不用Met（1 mmol/L）处理48小时。用AMPK和LC3B抗体对细胞裂解物进行Western blot分析(n个= 3; *P（P）<0.05 vs.C-siRNA，†P（P）<0.05 vs.HG/C-siRNA，P（P）<0.05 vs.HG/Met/C-siRNA）。J型：将感染GFP或CA-AMPK腺病毒的H9c2细胞在HG培养基中培养48 h。将细胞裂解物进行Western blot检测LC3的表达(n个= 3; *P（P）<0.05与GFP，†P（P）<0.05 vs.GFP/HG，P（P）与单独的CA-AMPK相比<0.05，♣P（P）与GFP/HG/Met相比<0.05#P（P）<0.05 vs.CA-AMPK/HG）。
图2。
图2。
AMPK激活抑制高糖（HG）诱导的H9c2细胞凋亡。A类和B类：H9c2细胞暴露于5 mmol/Ld日-葡萄糖（对照），30 mmol/Ld日-葡萄糖（HG），或5.5 mmol/Ld日-葡萄糖加24.5mmol/L甘露醇48小时。然后进行TUNEL染色(A类)以及TUNEL阳性细胞的数量(B类)量化了(n个= 6; *P（P）与对照组或甘露醇相比<0.05）。C类：通过免疫印迹分析测定裂解的胱天蛋白酶3（C-Casp3）和裂解的PARP（C-PARP）(n个=5*P（P）与对照组相比<0.05）。D类和E类：采用FITC-膜联蛋白V/PI双染流式细胞术检测不同组H9c2细胞的凋亡率。D类：膜联蛋白V/PI染色代表图。E类：凋亡细胞计算为膜联蛋白V的比率+/PI公司−单元格到总单元格(n个=5*P（P）与对照组或甘露醇相比<0.05）。F类：H9c2细胞用或不用二甲双胍（Met；1 mmol/L）预处理1 h，然后用HG（30 mmol/L）处理48 h。通过AMPK和ACC磷酸化的Western分析测定细胞裂解液中AMPK的活化(n个=5*P（P）<0.05与对照组，†P（P）与HG相比<0.05）。G公司：通过Western blot分析检测细胞裂解物中C-Casp3和C-PARP的表达(n个=5*P（P）<0.05与对照组，†P（P）与HG相比<0.05）。小时：采用annexin V/PI双重染色的流式细胞术检测细胞凋亡，并计算凋亡细胞与annexinV的比值+/PI公司−单元格到总单元格(n个=5*P（P）<0.05与对照组，†P（P）与HG相比<0.05）。
图3。
图3。
AMPK通过诱导自噬减轻高糖（HG）诱导的细胞凋亡。A类和B类：H9c2细胞用3-MA（10μmol/L）预处理30 min，然后在有或无二甲双胍（Met；1 mmol/L）的情况下用HG（30 mmol/L.）处理48 h。用Western blot分析细胞裂解产物以确定LC3的表达(A类)和凋亡标记物(B类)包括裂解caspase-3（C-Casp3）和裂解PARP（C-PARP）(n个=5*P（P）与对照组相比<0.05，†P（P）<0.05 vs.HG，P（P）<0.05 vs.HG/Met）。C类：用对照siRNA（C-siRNA）或Atg7 siRNA（Atg7-si）转染H9c2细胞48小时。细胞在HG培养基中培养，并用或不用Met（1 mmol/L）处理48小时。用C-Casp3、C-PARP、LC3B和Atg7抗体对细胞裂解物进行Western blot分析。D类：采用annexin V/PI双重染色的流式细胞术检测细胞凋亡，并计算凋亡细胞与annexinV的比值+/PI公司−单元格到总单元格(n个=5*P（P）<0.05与对照/C-siRNA，†P（P）<0.05 vs.C-siRNA/HG，P（P）与HG/Met/C-siRNA相比<0.05）。E类用编码GFP或Atg7的腺病毒感染H9c2细胞48小时，然后用或不用CQ（5μmol/L）处理16小时。用Western blot检测细胞裂解液中LC3的表达(n个=5*P（P）<0.05与GFP，†P（P）与CQ/GFP相比<0.01）。F类：用GFP或Atg7腺病毒感染的H9c2细胞在HG培养基中孵育48小时。对细胞裂解物进行蛋白质印迹以确定C-Casp3和C-PARP的表达(n个=5*P（P）<0.05与GFP，†P（P）<0.05 vs.GFP/HG）。G公司：采用annexin V/PI双重染色的流式细胞术检测细胞凋亡，并计算凋亡细胞与annexinV的比值+/PI公司−单元格到总单元格(n个=5*P（P）<0.05与GFP，†P（P）<0.05 vs.GFP/HG）。
图4。
图4。
AMPK激活JNK来调节Beclin1-Bcl-2的结合，诱导自噬，并减少凋亡细胞死亡。A类和B类：H9c2细胞用或不用二甲双胍（Met；1 mmol/L）预处理1 h，然后在高糖（HG；30 mmol/L）培养基中培养48 h。Beclin1(A类)或Bcl-2(B类)从细胞裂解物中获得免疫沉淀（IP），并通过Western blot（IB）检测免疫沉淀中的Bcl-2或Beclin1(n个= 4; *P（P）<0.05与对照组【对比】，†P（P）与HG相比<0.05）。C类：H9c2细胞在二甲双胍（Met；1 mmol/L）存在或不存在的情况下用HG（30 mmol/L）处理24或36 h。使用抗磷酸JNK1（Thr183/Tyr185）抗体通过Western blot检测JNK1的激活(n个=5*P（P）<0.05与Con，†P（P）与HG相比<0.05）。C类,正确的：在正常或HG下用二甲双胍（1 mmol/L）处理H9c2细胞36 h。通过Western blot测定JNK1磷酸化(n个= 3; *P（P）<0.05与Con，†P（P）与HG相比<0.05）。D类：用抗-Bcl-2抗体免疫沉淀细胞裂解物，然后使用P-Bcl-2（Ser70）和Bcl-2抗体进行免疫印迹(n个=5*P（P）<0.05相对于Con，†P（P）与HG相比<0.05）。D类,正确的：在正常葡萄糖或HG条件下，用Met（1 mmol/L）处理H9c2细胞36小时。通过免疫沉淀和Western blotting测定Bcl-2的磷酸化(n个= 3; *P（P）<0.05与Con，†P（P）与HG相比<0.05）。E类：H9c2细胞用SP600125（SP；50μmol/L）预处理30 min，然后在HG（30 mmol/L）培养基中培养48 h，在有或无Met（1 mmol/L.）的情况下培养48 h。Western blot检测总JNK1和磷酸化JNK1。此外，用抗Beclin1抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，用抗Bcl-2抗体对免疫沉淀进行免疫印迹(n个=5*P（P）<0.05与Con，†P（P）<0.05 vs.HG，P（P）与HG/Met相比<0.01）。F类：通过Western blot分析LC3的表达(n个=5*P（P）<0.05与Con，†P（P）<0.05 vs.HG，P（P）与HG/Met相比<0.01）。G公司：用LacZ或CA-JNK1质粒转染H9c2细胞24 h，然后在HG培养基中孵育36 h，Western blot检测JNK1。细胞裂解物用抗Beclin1抗体进行免疫沉淀，然后用Western blotting检测免疫沉淀中的Bcl-2(n个=5*P（P）与LAZ/Con相比<0.05†P（P）<0.05 vs.HG/LacZ）。小时：通过Western blot分析LC3的表达(n个=5*P（P）与LAZ/Con相比<0.05†P（P）<0.05 vs.HG/LacZ）。我：用SP（50μmol/L）预处理H9c2细胞30 min，然后用HG（30 mmol/L）在有或无Met（1 mmol/L）的情况下处理48 h。用抗-C-Casp3和抗-C-PARP抗体对细胞裂解物进行Western blot(n个=5*P（P）<0.05与对照组，†P（P）<0.05 vs.HG，P（P）<0.05 vs.HG/Met）。J型：用膜联蛋白V-PI双重染色流式细胞术检测细胞凋亡，并计算凋亡细胞与膜联蛋白V的比值+/PI公司−单元格到总单元格(n个=5*P（P）<0.05与对照组，†P（P）<0.05 vs.HG，P（P）<0.05 vs.HG/Met）。
图5：。
图5：。
AMPK磷酸化JNK1。A类：用指定浓度的二甲双胍（Met）处理H9c2细胞36 h。对细胞裂解物进行P-AMPK（Thr172）和P-JNK1（Thr183/Tyr185）的Western分析(n个= 3; *P（P）与对照组相比<0.05[续]）。B类：将重组JNK1（500ng）与指定浓度的重组AMPK一起孵育。通过Western blotting测定JNK1的磷酸化(n个= 3; *P（P）与对照组相比<0.05）。C类：H9c2细胞在正常葡萄糖和HG下用Met（1 mmol/L）处理36 h。通过免疫沉淀（IP）和免疫印迹（IB）测定AMPK和JNK1的相互作用(n个= 3; *P（P）<0.05与对照组，†P（P）与HG相比<0.05）。D类：用对照siRNA（C-siRNA）或mTOR-siRNA（mTOR-si）转染H9c2细胞48 h，然后在HG（30 mmol/L）培养基中培养48 h。通过免疫沉淀和Western blotting检测Beclin1和Bcl-2的结合(n个= 3; NS，不显著）。
图6。
图6。
AMPK的激活扰乱了Bcl-2–Beclin1的关联并恢复糖尿病心脏的自噬。A类：使用P-AMPK（Thr172）和P-ACC（Ser79）抗体通过蛋白质印迹检测FVB（对照）、二甲双胍处理的FVB（Met）、STZ处理的（STZ）和二甲双胍处理的STZ（STZ/Met）小鼠心脏组织中AMPK和ACC的磷酸化，并通过密度计定量(n个=每组6人*P（P）<0.05与Con，†P（P）与STZ相比<0.05）。B类：通过Western blotting分析心脏组织中总JNK1和磷酸化JNK1的表达。此外，用抗-Bcl-2抗体对心脏组织进行免疫沉淀（IP），然后使用P-Bcl-2（Ser70）、Beclin1和Bcl-2抗体通过免疫印迹（IB）检测免疫沉淀。所示结果代表了三个独立的实验。C类：心脏组织进行Western blotting，以使用特定抗体确定LC3的表达(n个=每组5人*P（P）<0.05与Con，†P（P）与STZ相比<0.05）。D类：心脏组织中AMPK活性的测定如研究设计与方法(n个=5*P（P）<0.05与WT/Con，†P（P）<0.05 vs.WT/STZ，P（P）<0.05 vs.WT/STZ/Met）。E类：FVB（WT）和DN-AMPKα2（DN）转基因小鼠接受或不接受STZ治疗。通过Western blotting测定心脏组织中的LC3-II蛋白水平(n个=5*P（P）<0.05 vs.WT）。F类：用或不用二甲双胍（Met）治疗糖尿病WT和DN小鼠，然后对这些小鼠的心脏匀浆进行Western blot检测LC3的表达(n个=5*P（P）<0.05与WT/STZ，†P（P）<0.05 vs.WT/STZ/Met）。G公司：通过Western blot检测FVB对照（Con）、STZ和STZ/Met小鼠心脏组织中Akt在Ser437的磷酸化，并通过密度测定法进行量化(n个=每组6人*P（P）<0.05与Con，†P（P）与STZ相比<0.05）。
图7。
图7。
激活AMPK可防止糖尿病心脏细胞凋亡。A类：TUNEL染色的代表性图像。用TUNEL染色法标记对照组、二甲双胍处理的FVB（Met）、STZ处理的STZ（STZ）和二甲双胍-处理的STZ/Met（STZ/Met）小鼠心脏切片中的凋亡细胞。B类：条形图中显示TUNEL阳性细胞的数量(n个=每组6人*P（P）与对照组相比<0.05，†P（P）与STZ相比<0.05）。C类和D类心脏匀浆中裂解caspase-3（C-Caspa3）和裂解PARP（C-PARP）的西方分析(n个=5*P（P）<0.05与对照组，†P（P）与STZ相比<0.05）。E类：FVB（WT）和DN-AMPKα2（DN）转基因小鼠用或不用STZ处理，然后对心脏组织进行Western blot分析，以测定C-Casp3和C-PARP的表达(n个=每组5人*P（P）<0.05与WT，†P（P）<0.05 vs.DN）。F类：用或不用二甲双胍（Met）治疗糖尿病WT和DN小鼠，然后对心脏匀浆进行Western blot检测C-Casp3和C-PARP的表达(n个=5*P（P）<0.05与WT/STZ，†P（P）<0.05 vs.WT/STZ/Met）。
图8。
图8。
二甲双胍改善糖尿病心脏的心脏纤维化和心脏功能。A类心脏组织中I型胶原的免疫组织化学染色。对照组、二甲双胍处理的FVB（Met）、STZ处理的STZ（STZ）和二甲双胍-处理的STZ（Met/STZ）小鼠的心脏切片用I型胶原抗体染色，细胞核用苏木精复染。B类：I型胶原染色区域的定量分析如条形图所示(n个=每组6人*P（P）<0.05与对照组，†P（P）与STZ相比<0.05）。C类——E类：通过Langendorff灌注分析确定对照组、STZ和STZ/Met小鼠LV发展压力和体积之间的关系。STZ小鼠产生的压力降低，二甲双胍治疗可以预防这种抑制(C类). 二甲双胍改善LV dp/dt最大值(D类)和dp/dt最小值(E类)STZ小鼠(n个=每组6人*P（P）<0.05与对照组，†P（P）与STZ相比<0.05）。
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