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.2013年1月15日；19(2):380-92.
doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-1555。 Epub 2012年12月4日。

c-Src活化通过刺激c-Met介导头颈癌对厄洛替尼的耐药性

劳拉·P·斯塔比尔 1, 何国庆, 薇薇安·魏燕璐, 苏菲·托马斯, 卡桑德拉·亨利, 克里斯托弗·古比什, 索纳利·乔伊斯, 凯利·M·奎斯内尔, 吉尔·M·齐格弗里德, 詹妮弗·格兰迪斯
附属公司

c-Src活化通过刺激c-Met介导头颈癌对厄洛替尼的耐药性

劳拉·P·斯塔比尔等。 临床癌症研究. .

勘误表in

  • 《临床癌症研究》，2013年7月1日；19(13):3715. 托马斯·苏菲[补充]

摘要

目的：使用酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼抑制EGF受体（EGFR）的策略与头颈部鳞癌（HNSCC）的临床疗效有限有关。替代激酶的协同激活可能导致埃洛替尼耐药。

实验设计：我们生成表达显性活性c-Src（DA-Src）的HNSCC细胞，以确定c-Src-激活对埃洛替尼反应的贡献。

结果：与转染载体的对照细胞相比，DA-Src的表达在体内外对厄洛替尼产生了耐药性。磷酸蛋氨酸被DA-Src强烈上调，DA-Src-细胞不产生肝细胞生长因子（HGF）。敲除c-Met可提高体外DA-Src细胞对厄洛替尼的敏感性，如将c-Met或c-Src抑制剂与厄洛替尼联用一样。抑制EGFR导致DA-Src细胞中磷酸化-Met的最小减少，而通过抑制c-Src实现磷酸化-Met的完全抑制。c-Met抑制剂在体内对埃洛替尼显著致敏DA Src肿瘤，导致Ki67标记减少和细胞凋亡增加。在亲代细胞中，内源性c-Src的敲除增强了对厄洛替尼的敏感性，而用HGF直接诱导磷酸化-Met的治疗则导致厄洛替尼可耐药。HNSCC细胞株内源性磷酸化c-Src水平也与厄洛替尼耐药显著相关。

结论：c-Met的配体依赖性激活在c-Src激活的HNSCC中特别有助于厄洛替尼抵抗，而非西妥昔单抗抵抗，其中c-Met激活更依赖于c-Src而非EGFR，提供了一种替代的生存途径。在厄洛替尼中添加c-Met或c-Src抑制剂可能会提高激活c-Srcs患者EGFR抑制的疗效。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者没有利益冲突需要报告。

数字

图1
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活化的c-Src对厄洛替尼产生耐药性在体外（A） 通过Western blotting检测8个代表性HNSCC细胞中p-EGFR、总EGFR、p-Src和总c-Src的表达。β-管蛋白显示为负载控制。每个印迹下方显示了归一化为β-微管蛋白的每个蛋白质的相对密度定量。实验进行了三次，结果相似。（B） 通过Western blotting验证表达活化c-Src（DA-Src-3，DA-Src-5）的稳定细胞与载体控制细胞（VC-1和VC-2）的比较。比较p-Src、c-Src总量、p-EGFR和EGFR总量的蛋白表达水平。图中显示了3个独立实验的累积密度测定p-Src结果。（C） 用不同剂量的厄洛替尼处理VC和DA-Src克隆，然后在48小时进行MTT分析。
图1
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活化的c-Src对厄洛替尼产生耐药性在体外（A） 通过Western blotting检测8个代表性HNSCC细胞中p-EGFR、总EGFR、p-Src和总c-Src的表达。β-微管蛋白作为负载对照。每个印迹下方显示了归一化为β-微管蛋白的每个蛋白质的相对密度定量。实验进行了三次，结果相似。（B） 通过Western blotting验证表达活化c-Src（DA-Src-3，DA-Src-5）的稳定细胞与载体控制细胞（VC-1和VC-2）的比较。比较p-Src、c-Src总量、p-EGFR和EGFR总量的蛋白表达水平。图中显示了3个独立实验的累积密度测定p-Src结果。（C） 用不同剂量的厄洛替尼处理VC和DA-Src克隆，然后在48小时进行MTT分析。
图1
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活化的c-Src对厄洛替尼产生耐药性在体外（A） 通过Western blotting检测8个代表性HNSCC细胞中p-EGFR、总EGFR、p-Src和总c-Src的表达。β-管蛋白显示为负载控制。每个印迹下方显示了归一化为β-微管蛋白的每个蛋白质的相对密度定量。实验进行了三次，结果相似。（B） 通过Western blotting验证表达活化c-Src（DA-Src-3，DA-Src-5）的稳定细胞与载体控制细胞（VC-1和VC-2）的比较。比较p-Src、c-Src总量、p-EGFR和EGFR总量的蛋白表达水平。图中显示了3个独立实验的累积密度测定p-Src结果。（C） 用不同剂量的厄洛替尼处理VC和DA-Src克隆，然后在48小时进行MTT分析。
图2
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c-Src活化有助于厄洛替尼耐药，但不影响西妥昔单抗耐药体内（A）将VC-2和DA-Src-5 HNSCC细胞接种到裸鼠侧面。每周用载体对照物（20%特拉普酚）或40mg/kg厄洛替尼经口灌胃给小鼠治疗5天，为期4周。肿瘤植入后5天开始治疗。结果表示每个治疗组14个肿瘤的平均肿瘤体积±S.E。未配对学生t检验，*P<0.05。（B） Ki67对细胞增殖细胞进行免疫组化染色的代表性图像和定量结果，Tunel分析对凋亡细胞进行免疫组织化学染色。结果显示为每个区域凋亡细胞或Ki67阳性细胞的平均数±S.E.未配对Student t检验，P<0.05*，P<0.0005***。比例尺=50μm。（C） 1×106将DA-Src-5 HNSCC细胞接种于裸鼠侧腹部。每周用溶媒对照品（生理盐水）或0.03mg西妥昔单抗腹腔注射给小鼠2天，持续13天。肿瘤植入15天后开始治疗。结果表示每个治疗组7个肿瘤的平均肿瘤体积±S.E。未配对学生t检验，*P<0.05。
图2
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c-Src激活导致埃洛替尼耐药性，但不导致西妥昔单抗耐药性体内（A）将VC-2和DA-Src-5 HNSCC细胞接种到裸鼠侧面。小鼠每周用载体对照（20%traptsol）或40mg/kg厄洛替尼经口灌胃治疗5天，持续4周。肿瘤植入后5天开始治疗。结果表示每个治疗组14个肿瘤的平均肿瘤体积±S.E。未配对学生t检验，*P<0.05。（B） Ki67对细胞增殖细胞进行免疫组化染色的代表性图像和定量结果，Tunel分析对凋亡细胞进行免疫组织化学染色。结果显示为每个区域凋亡细胞或Ki67阳性细胞的平均数±S.E.未配对Student t检验，P<0.05*，P<0.0005***。比例尺=50μm。（C） 1×106将DA-Src-5 HNSCC细胞接种于裸鼠侧腹部。每周用溶媒对照品（生理盐水）或0.03mg西妥昔单抗腹腔注射给小鼠2天，持续13天。肿瘤植入15天后开始治疗。结果表示每个治疗组7个肿瘤的平均肿瘤体积±S.E。无配对学生t检验，*P<0.05。
图2
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c-Src活化有助于厄洛替尼耐药，但不影响西妥昔单抗耐药体内（A）将VC-2和DA-Src-5 HNSCC细胞接种到裸鼠侧面。每周用载体对照物（20%特拉普酚）或40mg/kg厄洛替尼经口灌胃给小鼠治疗5天，为期4周。肿瘤植入后5天开始治疗。结果表示每个治疗组14个肿瘤的平均肿瘤体积±S.E。未配对学生t检验，*P<0.05。（B） Ki67对细胞增殖细胞进行免疫组化染色的代表性图像和定量结果，Tunel分析对凋亡细胞进行免疫组织化学染色。结果显示为每个区域凋亡细胞或Ki67阳性细胞的平均数±S.E.未配对Student t检验，P<0.05*，P<0.0005***。比例尺=50μm。（C） 1×106将DA-Src-5 HNSCC细胞接种于裸鼠侧腹部。每周用溶媒对照品（生理盐水）或0.03mg西妥昔单抗腹腔注射给小鼠2天，持续13天。肿瘤植入15天后开始治疗。结果表示每个治疗组7个肿瘤的平均肿瘤体积±S.E。未配对学生t检验，*P<0.05。
图3
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活化的c-Src在HNSCC细胞中诱导显著的c-Met磷酸化。（A） VC-1和VC-2细胞以及DA-Src-3和DA-Src-5细胞中p-c-Met和总c-Met的表达水平。底部面板中显示的代表性斑点的密度测定量化。在至少3个独立实验中观察到类似的结果。（B） 用200nM达沙他尼或1μM厄洛替尼处理DA-Src-5细胞24小时。制备细胞裂解物并分析p-EGFR、p-c-Met和p-Src的表达。显示了具有代表性的蛋白质印迹，并且来自3个独立实验的p-c-Met表达的定量标准化为β-微管蛋白。P<0.0001***，ns=无显著性。（C） 在达沙替尼或埃洛替尼治疗（B）后，评估一组含有不同埃洛替尼EC50s（1.56–13.14μM）的8个HNSCC细胞系（CAL-33、UM-SCC-22A、HN-5、PCI-15B、VC-1、VC-2、DA-Src-3、DA-Src-5）的磷酸化-Met表达。计算并分析达沙替尼处理细胞中观察到的残余磷酸化-Met表达与厄洛替尼处理的细胞[磷酸化-Met-表达（达沙替尼布/厄洛替尼布）]中所观察到的剩余磷酸化-Met表达的密度比与厄洛替尼EC的相关性50.
图3
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活化的c-Src在HNSCC细胞中诱导显著的c-Met磷酸化。（A） VC-1和VC-2细胞以及DA-Src-3和DA-Src-5细胞中p-c-Met和总c-Met的表达水平。底部面板中显示的代表性斑点的密度测定量化。在至少3个独立实验中观察到类似的结果。（B） 用200nM达沙他尼或1μM厄洛替尼处理DA-Src-5细胞24小时。制备细胞裂解物并分析p-EGFR、p-c-Met和p-Src的表达。显示了具有代表性的蛋白质印迹，并且来自3个独立实验的p-c-Met表达的定量标准化为β-微管蛋白。P<0.0001***，ns=无显著性。（C） 在达沙替尼或埃洛替尼治疗（B）后，评估一组含有不同埃洛替尼EC50s（1.56–13.14μM）的8个HNSCC细胞系（CAL-33、UM-SCC-22A、HN-5、PCI-15B、VC-1、VC-2、DA-Src-3、DA-Src-5）的磷酸化-Met表达。计算并分析达沙替尼处理细胞中观察到的残余磷酸化-Met表达与厄洛替尼处理的细胞[磷酸化-Met-表达（达沙替尼布/厄洛替尼布）]中所观察到的剩余磷酸化-Met表达的密度比与厄洛替尼EC的相关性50.
图3
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活化的c-Src在HNSCC细胞中诱导显著的c-Met磷酸化。（A） VC-1和VC-2细胞以及DA-Src-3和DA-Src-5细胞中p-c-Met和总c-Met的表达水平。底部面板中显示的代表性斑点的密度测定量化。在至少3个独立实验中观察到类似的结果。（B） 用200nM达沙他尼或1μM厄洛替尼处理DA-Src-5细胞24小时。制备细胞裂解物并分析p-EGFR、p-c-Met和p-Src的表达。显示了一个具有代表性的Western blot，并且p-c-Met表达的定量从3个独立实验归一化为β-微管蛋白。P<0.0001***，ns=无显著性。（C） 在达沙替尼或埃洛替尼治疗（B）后，评估一组含有不同埃洛替尼EC50s（1.56–13.14μM）的8个HNSCC细胞系（CAL-33、UM-SCC-22A、HN-5、PCI-15B、VC-1、VC-2、DA-Src-3、DA-Src-5）的磷酸化-Met表达。计算并分析达沙替尼处理细胞中观察到的残余磷酸化-Met表达与厄洛替尼处理的细胞[磷酸化-Met-表达（达沙替尼布/厄洛替尼布）]中所观察到的剩余磷酸化-Met表达的密度比与厄洛替尼EC的相关性50.
图4
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DA-Src细胞中siRNA对c-Met的特异性敲除可恢复对厄洛替尼的敏感性。用c-Met或对照siRNA（300pmoles）瞬时转染686LN DA-Src-5细胞48小时，然后用厄洛替尼按指定剂量治疗。48小时后用MTT法评估细胞活力。显示了三个独立实验的结果。学生t检验，*P<0.05。通过Western blotting（插图）证实c-Met的敲除。（B） 用0.1μM和0.5μM厄洛替尼单独或与PF04217903（1μM）或达沙替尼（EC）联合处理686LN DA-Src-5细胞50，380nM）培养48小时，然后进行MTT测定。显示了三个独立实验的结果。学生t检验，*P=0.010，**P=0.003，***P<0.0001。（C） DA-Src-5荷瘤小鼠每周5天通过口服灌胃接受以下治疗，共4周：溶媒对照、厄洛替尼（40mg/kg）、PF04217903（15mg/kg）或联合治疗。肿瘤植入后6天开始治疗。结果表示每个治疗组12个肿瘤的平均肿瘤体积±S.E。未配对学生t检验，*P=0.0068与对照组比较。（D） Ki67对细胞增殖细胞进行免疫组化染色的代表性图像和定量结果，Tunel分析对凋亡细胞进行免疫组织化学染色。结果显示为每个区域凋亡细胞或Ki67阳性细胞的平均数±S.E.未配对Student t检验，P<0.05*，P<0.0005***。比例尺=50μm。
图4
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DA-Src细胞中siRNA对c-Met的特异性敲除可恢复对厄洛替尼的敏感性。用c-Met或对照siRNA（300pmoles）瞬时转染686LN DA-Src-5细胞48小时，然后用厄洛替尼按指定剂量治疗。48小时后通过MTT法评估细胞活力。显示了三个独立实验的结果。学生t检验，*P<0.05。通过Western blotting（插图）证实c-Met的敲除。（B） 用0.1μM和0.5μM厄洛替尼单独或与PF04217903（1μM）或达沙替尼（EC）联合处理686LN DA-Src-5细胞50，380nM）48小时，然后进行MTT分析。显示了三个独立实验的结果。学生t检验，*P=0.010，**P=0.003，***P<0.0001。（C） DA-Src-5荷瘤小鼠每周5天通过口服灌胃接受以下治疗，共4周：溶媒对照、厄洛替尼（40mg/kg）、PF04217903（15mg/kg）或联合治疗。肿瘤植入后6天开始治疗。结果表示每个治疗组12个肿瘤的平均肿瘤体积±S.E。未配对学生t检验，*P=0.0068与对照组比较。（D） Ki67对细胞增殖细胞进行免疫组化染色的代表性图像和定量结果，Tunel分析对凋亡细胞进行免疫组织化学染色。结果显示为每个区域凋亡细胞或Ki67阳性细胞的平均数±S.E.未配对Student t检验，P<0.05*，P<0.0005***。比例尺=50μm。
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DA-Src细胞中siRNA对c-Met的特异性敲除可恢复对厄洛替尼的敏感性。用c-Met或对照siRNA（300pmoles）瞬时转染686LN DA-Src-5细胞48小时，然后用厄洛替尼按指定剂量治疗。48小时后用MTT法评估细胞活力。显示了三个独立实验的结果。学生t检验，*P<0.05。通过Western blotting（插图）证实c-Met的敲除。（B） 用0.1μM和0.5μM厄洛替尼单独或与PF04217903（1μM）或达沙替尼（EC）联合处理686LN DA-Src-5细胞50，380nM）48小时，然后进行MTT分析。显示了三个独立实验的结果。学生t检验，*P=0.010，**P=0.003，***P<0.0001。（C） DA-Src-5荷瘤小鼠每周5天通过口服灌胃接受以下治疗，共4周：溶媒对照、厄洛替尼（40mg/kg）、PF04217903（15mg/kg）或联合治疗。肿瘤植入后6天开始治疗。结果表示每个治疗组12个肿瘤的平均肿瘤体积±S.E。未配对学生t检验，*P=0.0068与对照组比较。（D） Ki67对细胞增殖细胞进行免疫组化染色的代表性图像和定量结果，Tunel分析对凋亡细胞进行免疫组织化学染色。结果显示为每个区域凋亡细胞或Ki67阳性细胞的平均数±S.E.未配对Student t检验，P<0.05*，P<0.0005***。比例尺=50μm。
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DA-Src细胞中siRNA对c-Met的特异性敲除可恢复对厄洛替尼的敏感性。用c-Met或对照siRNA（300pmoles）瞬时转染686LN DA-Src-5细胞48小时，然后用厄洛替尼按指定剂量治疗。48小时后用MTT法评估细胞活力。显示了三个独立实验的结果。学生t检验，*P<0.05。通过蛋白质印迹证实了c-Met的敲除（插图）。（B） 用0.1μM和0.5μM厄洛替尼单独或与PF04217903（1μM）或达沙替尼（EC）联合处理686LN DA-Src-5细胞50，380nM）48小时，然后进行MTT分析。显示了三个独立实验的结果。学生t检验，*P=0.010，**P=0.003，***P<0.0001。（C） DA-Src-5荷瘤小鼠每周5天通过口服灌胃接受以下治疗，共4周：溶媒对照、厄洛替尼（40mg/kg）、PF04217903（15mg/kg）或联合治疗。肿瘤植入后6天开始治疗。结果表示每个治疗组12个肿瘤的平均肿瘤体积±S.E。未配对学生t检验，*P=0.0068与对照组比较。（D） Ki67对细胞增殖细胞进行免疫组化染色的代表性图像和定量结果，Tunel分析对凋亡细胞进行免疫组织化学染色。结果显示为每个区域凋亡细胞或Ki67阳性细胞的平均数±S.E.未配对Student t检验，P<0.05*，P<0.0005***。比例尺=50μm。
图5
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siRNA对c-Src的特异性敲除增强了HNSCC细胞对厄洛替尼的敏感性。（A） 686LN和FaDu HNSCC细胞（1×105/well）转染c-Src siRNA或对照siRNA（300pmoles）48小时。通过Western blotting在两种细胞系中观察到c-Src-敲除。显示了具有代表性的Western印迹结果。β-微管蛋白作为负荷对照。与β-微管蛋白相比，密度测定结果显示在每个印迹下方。在3个独立实验中观察到类似的结果。（B，C）C-Src siRNA或对照siRNA转染剂（686LN和FaDu）以指定剂量（EC）用二甲基亚砜或埃洛替尼处理50和亚EC50各细胞系的剂量）。48小时后通过MTT法评估细胞活力。显示了三个独立实验的结果。P<0.0001***，P<0.01**（D）686LN亲代细胞在含有重组人HGF（50ng/ml）或载体对照物的24孔板中培养。在用MTT分析之前，在载体或HGF的持续存在下对细胞进行厄洛替尼处理48小时。通过Western blotting（插图）确认磷酸化-c-Met激活。P<0.0001。
图5
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siRNA对c-Src的特异性敲除增强了HNSCC细胞对厄洛替尼的敏感性。（A） 686LN和FaDu HNSCC细胞（1×105/well）转染c-Src siRNA或对照siRNA（300pmoles）48小时。通过Western blotting在两种细胞系中观察到c-Src-敲除。显示了具有代表性的Western印迹结果。β-微管蛋白作为负荷对照。与β-微管蛋白相比，密度测定结果显示在每个印迹下方。在3个独立实验中观察到类似的结果。（B，C）C-Src-siRNA或对照siRNA转染子（686LN和FaDu）用DMSO或埃洛替尼以指定剂量处理（EC50和亚EC50各细胞系的剂量）。48小时后用MTT法评估细胞活力。显示了三个独立实验的结果。P<0.0001***，P<0.01**（D）686LN亲代细胞在含有重组人HGF（50ng/ml）或载体对照物的24孔板中培养。在MTT分析之前，细胞在载体或HGF的持续存在下接受厄洛替尼治疗48小时。通过Western blotting（插图）确认磷酸化-c-Met激活。P<0.0001。
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siRNA对c-Src的特异性敲除增强了HNSCC细胞对厄洛替尼的敏感性。（A） 686LN和FaDu HNSCC细胞（1×105/well）转染c-Src siRNA或对照siRNA（300pmoles）48小时。通过Western blotting在两种细胞系中观察到c-Src-敲除。显示了具有代表性的Western印迹结果。β-微管蛋白作为负荷对照。与β-微管蛋白相比，密度测定结果显示在每个印迹下方。在3个独立实验中观察到类似的结果。（B，C）C-Src siRNA或对照siRNA转染剂（686LN和FaDu）以指定剂量（EC）用二甲基亚砜或埃洛替尼处理50和亚EC50各细胞系的剂量）。48小时后用MTT法评估细胞活力。显示了三个独立实验的结果。P<0.0001***，P<0.01**（D）686LN亲代细胞在含有重组人HGF（50ng/ml）或载体对照物的24孔板中培养。在MTT分析之前，细胞在载体或HGF的持续存在下接受厄洛替尼治疗48小时。通过Western blotting（插图）确认磷酸化-c-Met激活。P＜0.0001。
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siRNA对c-Src的特异性敲除增强了HNSCC细胞对厄洛替尼的敏感性。（A） 686LN和FaDu HNSCC细胞（1×105/well）转染c-Src siRNA或对照siRNA（300pmoles）48小时。通过Western blotting在两种细胞系中观察到c-Src-敲除。显示了具有代表性的Western印迹结果。β-微管蛋白作为负荷对照。与β-微管蛋白相比，密度测定结果显示在每个印迹下方。在3个独立实验中观察到类似的结果。（B，C）C-Src siRNA或对照siRNA转染剂（686LN和FaDu）以指定剂量（EC）用二甲基亚砜或埃洛替尼处理50和亚EC50各细胞系的剂量）。48小时后用MTT法评估细胞活力。显示了三个独立实验的结果。P＜0.0001***，P＜0.01**（D）686LN亲代细胞在重组人HGF（50ng/ml）或载体对照存在下接种在24孔板中。在MTT分析之前，细胞在载体或HGF的持续存在下接受厄洛替尼治疗48小时。通过Western blotting（插图）确认磷酸化-c-Met激活。P<0.0001。
图6
图6
P-Src水平与厄洛替尼敏感性显著相关。一组8个HNSCC细胞株中的P-Src水平与厄洛替尼EC相关50值。
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