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.2012年12月28日；287(53):44508-17.
doi:10.1074/jbc。M112.424903。 Epub 2012年11月14日。

组蛋白去甲基化酶KDM6B促进上皮-间质转化

西瓦库马尔·拉马多斯 1, 陈晓红, 王存余
附属公司

组蛋白去甲基化酶KDM6B促进上皮-间质转化

西瓦库马尔·拉马多斯等。 生物化学杂志. .

勘误表in

摘要

上皮-间充质转化（EMT）是胚胎发育、组织修复控制、器官纤维化以及肿瘤侵袭和转移过程中发生的关键事件。虽然在理解EMT的分子调控方面取得了重大进展，但对EMT中染色质是如何被修饰的还知之甚少。组蛋白乙酰化和甲基化引起的染色质修饰决定了基因表达的精确控制。最近，组蛋白去甲基酶被发现通过去甲基化单、二或三甲基赖氨酸在基因表达中发挥重要作用。KDM6B（也称为JMJD3）是一种组蛋白去甲基化酶，可能通过从染色质中去除抑制性组蛋白H3赖氨酸27三甲基化标记来激活基因表达。在此，我们报道KDM6B通过刺激SNAI1的表达，在TGF-β诱导的乳腺上皮细胞EMT中发挥了许可作用。KDM6B由TGF-β诱导，KDM6B的敲除抑制TGF-α诱导的EMT。相反，KDM6B的过度表达诱导了间充质基因的表达并促进了EMT。染色质免疫沉淀（ChIP）分析显示，KDM6B通过去除组蛋白H3赖氨酸三甲基化标记促进SNAI1表达。我们对Oncomine数据库的分析始终发现，与正常乳腺组织相比，侵袭性乳腺癌中KDM6B的表达显著增加。KDM6B的敲除显著抑制乳腺癌细胞的侵袭。总之，我们的研究揭示了调控EMT和肿瘤细胞侵袭的新的表观遗传机制，并在靶向肿瘤转移方面具有重要意义。

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数字

图1。
图1。
TGF-β诱导的EMT需要KDM6B。 A类，用TGF-β（10 ng/ml）处理NMuMG细胞24 h。B类、对照组和TGF-β处理的NMuMG细胞总蛋白中EMT标记物的Western blotting。C类实时RT-PCR显示NMuMG细胞中Kdm6b表达的诱导是对TGF-β治疗的反应。数值为平均值±S.D(误差线)代表性实验的三份样品。D类，NMuMG细胞感染表达慢病毒Kdm6亿shRNA或干扰shRNA。Kdm6亿实时RT-PCR检测mRNA。数值为代表性实验中三份样品的平均值。E类TGF-β处理NMuMG/Scrsh和NMuMG/Kdm6bsh细胞24h。F类如图所示，用TGF-β处理NMuMG/Scrsh和NMuMG/Kdm6bsh细胞的不同时间点。G公司TGF-β处理NMuMG/Scrsh和NMuMG/Kdm6bsh细胞48h，然后进行免疫荧光染色。
图2。
图2。
在hMLE细胞中，KDM6B是TGF-β诱导EMT所必需的。 A类，hMLE细胞用TGF-β处理不同时间KDM6B系列实时RT-PCR定量表达。数值为平均值±S.D(误差线)代表性实验的三份样品。B类，MCF-10A细胞用TGF-β处理指定时间，并且KDM6B系列mRNA通过实时RT-PCR定量。C类，hMLE细胞被表达scramble shRNA的慢病毒感染KDM6B系列shRNA，和KDM6B系列实时RT-PCR检测mRNA。D类用TGF-β处理hMLE/Scrsh、hMLE/KDM6Bsh1和hMLE/KDM6Bsh2细胞8天。制备总细胞裂解物并通过Western blot分析进行检测。
图3。
图3。
KDM6B的过度表达促进EMT。 A类，MCF-10A细胞被表达KDM6B或空载体的逆转录病毒感染。实时RT-PCR分析KDM6B mRNA。B类MCF-10A细胞中KDM6B的过度表达诱导了EMT样表型。C类，从MCF-10A/EV和MCF-10A/KDM6B细胞制备总细胞裂解物并进行Western blotting分析。D类实时RT-PCR检测SNAI1 mRNA。E类用表达KDM6B或空载体的逆转录病毒感染MDCK细胞，实时RT-PCR分析KDM6BmRNA。F类MDCK细胞中KDM6B的过度表达诱导了纺锤状形态，免疫荧光染色显示，随着N-钙粘蛋白表达的诱导，E-钙粘蛋白的表达减少。G公司从MDCK/EV和MDCK/KDM6B细胞中分离出全细胞提取物并进行Western blot检测。H（H），表达式SNAI1公司和SNAI2公司实时RT-PCR检测。误差线、S.D。
图4。
图4。
的击倒Kdm6亿禁止斯奈伊1表达式。 A类用TGF-β处理NMuMG/Scrsh和NMuMG/Kdm6bsh细胞，并且斯奈伊1mRNA通过实时RT-PCR定量。**，第页< 0.01.B类，斯奈伊2mRNA通过实时RT-PCR定量。C类实时RT-PCR定量Sip1 mRNA。D类，扭转1mRNA通过实时RT-PCR定量。**，第页< 0.01.E类，用TGF-β处理hMLE/Scrsh、hMLE/KDM6Bsh1和hMLE/KDM6Bsh2细胞，并且SNAI1公司mRNA通过实时RT-PCR测定。**，第页< 0.01.误差线、S.D。
图5。
图5。
KDM6B通过去除H3K27me3促进SNAI1表达。 A类，NMuMG细胞感染表达Kdm6亿或空向量，以及Kdm6亿mRNA通过实时RT-PCR定量。B类从NMuMG/EV和NMuMG/Kdm6b细胞制备全细胞提取物，并进行Western blot检测。C类对NMuMG/EV和NMuMG/Kdm6b细胞进行免疫荧光染色，以检测N-cadherin和纤维连接蛋白的表达。D类如图所示，用TGF-β处理NMuMG/EV和NMuMG/Kdm6b细胞的不同时间点。斯奈伊1mRNA通过实时RT-PCR定量。数值为平均值±S.D(误差线)代表性实验的三份样品。E类，击倒Kdm6亿H3K27me3水平增加斯奈伊1启动子和过表达Kdm6亿H3K27me3水平降低斯奈伊1启动子，如通过ChIP测定所确定的。位于Snai1转录起始位点上游4kb的非靶区用作对照。F类Snai1的敲除抑制了Kdm6b诱导的NMuMG细胞中的间充质标志物。NMuMG/Kdm6b细胞转染Scramb或Snai1 siRNA。通过实时RT-PCR定量Snai 1、N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达。数值是来自代表性实验的一式三份样品的平均值。
图6。
图6。
KDM6B系列在浸润性乳腺癌中过度表达。 A类，KDM6B根据Finak的研究，浸润性乳腺癌的mRNA高于正常乳腺组织等。(28). *,第页< 0.001.B类和C类，KDM6B系列根据Radvanyi的研究，浸润性导管癌和小叶性乳腺癌的mRNA高于正常乳腺组织等。(29). *,第页< 0.005.
图7。
图7。
敲除KDM6B可降低SNAI1的表达并抑制MDA-MB-231细胞的侵袭。 A类，MDA-MB-231细胞转染KDM6B系列siRNA（MDA/siKDM6B）或干扰siRNA（MDA/siScr），以及KDM6B系列mRNA通过实时RT-PCR定量。数值是代表性实验中三份样品的平均值。B类，用HEMA-3试剂盒染色后的侵入细胞照片。C类、侵入细胞的定量测量。每个酒吧表示平均值±S.D(误差线)重复三次实验。**，第页< 0.01.D类TGF-β处理MDA/siScr和MDA/siKDM6B细胞。SNAI1公司实时RT-PCR检测mRNA表达。数值为代表性实验中三份样品的平均值±S.D.。**，第页< 0.01.E类从MDA/siScr和MDA/siKDM6B细胞中提取全细胞裂解物，并通过蛋白质印迹进行检测。F类，用HEMA-3试剂盒染色后侵入的NMuMG/EV和NMuMG/Kdm6b细胞的照片。G公司，定量测量侵入细胞。每个酒吧表示三次试验的平均值±S.D.。**，第页< 0.01.H（H）和我，KDM6B过表达诱导了MDCK细胞的侵袭性。每个酒吧表示三次试验的平均值±S.D.。**，第页< 0.01.
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