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.2012年10月23日；14（5）：R229。
doi:10.1186/ar4070。

脂肪因子脂联素通过一磷酸腺苷活化蛋白激酶介导具有强大的抗纤维化作用：纤维化治疗的新靶点

冯芳, 刘雷（Lei Liu）, 杨扬, Zenshiro Tamaki先生, 魏军（Jun Wei）, 罗伯塔·马兰戈尼, 斯瓦蒂·巴塔查里亚, 罗斯·S·夏, 叶伯平, 约翰·瓦尔加

脂肪因子脂联素通过一磷酸腺苷活化蛋白激酶介导具有强大的抗纤维化作用：纤维化治疗的新靶点

冯芳等。 关节炎研究与治疗. .

摘要

简介：硬皮病中的纤维化与胶原沉积和肌成纤维细胞积聚有关。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）是脂肪生成的主要调节因子，抑制转化生长因子β（TGF-β）诱导的纤维化前反应，其在硬皮病中的表达受损。脂联素（一种PPAR-γ调节的多效性脂肪因子）在调节成纤维细胞反应和调节PPAR-β作用中的作用尚不清楚。

方法：在单层培养的正常成纤维细胞和三维皮肤等效物中检测脂联素和腺苷单磷酸蛋白活化（AMP）激酶激动剂对纤维化基因表达和TGF-ß信号的调节。实时定量PCR检测皮肤成纤维细胞AdipoR1/2的表达。

结果：脂联素是一种由PPAR-γ直接调节的脂肪因子，在正常和硬皮病成纤维细胞中起到强大的抗纤维化信号作用，可消除各种纤维化刺激的刺激作用，并降低硬皮病纤维细胞中胶原基因表达的升高。脂联素反应通过AMP激酶介导，AMP激酶是一种燃料敏感细胞酶，通过阻断典型Smad信号传导来下调纤维化基因是必要和充分的。此外，我们证明，内源性脂联素至少部分解释了PPAR-γ配体的抗纤维化作用。

结论：这些发现揭示了细胞能量代谢与细胞外基质稳态之间的新联系，细胞外基质稳定与AMP激酶融合。由于患有进行性纤维化的硬皮病患者的脂联素及其受体水平受损，本研究结果表明脂联素表达或功能缺陷在硬皮病和其他慢性纤维化疾病的进行性纤维化形成中可能起作用。因此，在成纤维细胞中恢复脂联素信号轴可能是控制纤维化的一种新的药理学方法。

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数字

图1
图1
脂联素抑制胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白基因表达.合流控制(A-C公司)或硬皮病(D类)皮肤成纤维细胞与脂联素（5ug/ml）孵育24～36h。A类对总RNA进行实时qPCR。结果表示三次测定的平均值±SEM*P（P）<0.05, **P（P）<0.01.B、 D类用Western blot分析全细胞裂解产物。代表性放射自显影。C类成纤维细胞用I型胶原抗体（红色）或α-SMA抗体（绿色）免疫染色，或用DAPI染色（蓝色），并用共焦显微镜检查。代表性免疫荧光显微照片。原始放大倍数×60。α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；DAPI，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚；SEM，平均值标准误差。
图2
图2
脂联素减弱TGF-β诱导的促纤维化反应.A类在存在指示浓度的脂联素的情况下，将汇合的真皮成纤维细胞与TGF-β（2 ng/ml）孵育48小时。总RNA进行实时qPCR。结果表示三次测定的平均值±SEM。B类用脂联素特异性siRNA或对照siRNA预孵育成纤维细胞。SEM，平均值的标准误差；转化生长因子β
图3
图3
AMP激酶激动剂抑制纤维化前基因表达将二维单层培养物中的汇合真皮成纤维细胞与指定浓度的（A）AICAR或（B）二甲双胍24小时。总RNA进行实时qPCR。结果表示三次测定的平均值±SEM。C类成纤维细胞用I型胶原抗体进行免疫染色（红色），或用DAPI染色（蓝色）。代表性免疫荧光显微照片。原始放大倍数×60。D类成纤维细胞瞬时转染（SBE）4-用AICAR或二甲双胍（1mM）预处理luc 24小时，然后用TGF-β（10 ng/ml）预处理24小时。分析细胞裂解物的荧光素酶活性。结果表示三次测定的平均值±SEM。AICAR，5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-甲酰胺；DAPI，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚；SEM，平均值标准误差；TGF-β，转化生长因子-β。
图4
图4
AMP激酶激动剂减弱TGF-β诱导的三维全厚人皮肤纤维化反应将嵌入三维全厚皮肤等效物中的成纤维细胞与二甲双胍（1 mM）和TGF-β（5 ng/ml）孵育6天。实验结束时，收获了木筏。A类.实时qPCR。结果表示三次测定的平均值±SEM。B类.4μm厚的石蜡包埋切片用云杉红染色。当在偏振光下观察时，真皮室中成熟的高度交联的胶原纤维显示为红色，而不太成熟的含有少量交联的胶原纤维显示为黄色/绿色。代表性图像（原始放大倍数×40）。SEM，平均值标准误差；TGF-β，转化生长因子-β。
图5
图5
AMP激酶介导脂联素抑制肝纤维化前反应在含有或不含有化合物C（10 uM）的TGF-β（2 ng/ml）培养基中，用脂联素（5 ug/ml）在二维单层培养物中培养汇合的真皮成纤维细胞48小时。采集总RNA并进行实时qPCR。结果表示三次测定的平均值±SEM。SEM，平均值标准误差；TGF-β，转化生长因子-β。
图6
图6
脂联素介导PPAR的抗纤维化作用-γ配体将来自脂联素缺乏小鼠和野生型同窝小鼠的皮肤成纤维细胞与指定浓度的PGJ孵育2然后使用TGF-β（2 ng/ml）24小时。总RNA进行实时qPCR。结果表示三次测定的平均值±SEM。PGJ公司2，前列腺素J2; SEM，平均值标准误差；TGF-β，转化生长因子-β。
图7
图7
脂联素减弱脂多糖诱导的肝纤维化反应将汇合的真皮成纤维细胞与LPS（1 ug/ml）在不存在或存在脂联素（10 ug/ml）的情况下孵育24小时。总RNA进行实时qPCR。结果表示三次测定的平均值±SEM。脂多糖；SEM，平均值标准误差。
图8
图8
硬皮病中脂联素受体的表达。A类从硬皮病患者移植的融合成纤维细胞中分离出总RNA(n个=4）和健康对照(n个=4），并进行实时qPCR。结果表示三次测定的平均值±SEM。B类在公开的全基因组表达硬皮病皮肤活检微阵列数据集（GEO登录号：GSE9285）中询问AdipoR1/2 mRNA表达[31]。mRNA水平的折叠变化与整个队列中样本的平均表达水平进行了标准化。方框图表示上下四分位数的范围*P（P）<0.05. SEM，平均值标准误差。
图9
图9
脂联素抑制纤维化反应PPAR-γ配体诱导脂联素，脂联素触发AMP激酶的自分泌或旁分泌活化。AMP激酶反过来阻断TGF-β/Smad信号传导，并随后刺激纤维化前基因表达。PPAR-γ，过氧化物酶体增殖物激活受体γ；TGF-β，转化生长因子-β。
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