Attenuation of TNFSF10/TRAIL-induced apoptosis by an autophagic survival pathway involving TRAF2- and RIPK1/RIP1-mediated MAPK8/JNK activation

doi:10.4161/auto.22145

.2012年12月；8(12):1811-21.

doi:10.4161/auto.22145。 Epub 2012年10月10日。

通过涉及TRAF2和RIPK1/RIP1介导的MAPK8/JNK活化的自噬生存途径减轻TNFSF10/TRAIL诱导的凋亡

魏阳河¹, 王琼（音）, 詹宁斯·徐, 徐秀玲, 梅贝尔·T·帕迪拉, 任国盛, 新沟, 永林

附属公司

PMID： 23051914
预防性维修识别码：项目经理3541290
DOI（操作界面）： 10.4161/自动22145

通过涉及TRAF2和RIPK1/RIP1介导的MAPK8/JNK活化的自噬生存途径减轻TNFSF10/TRAIL诱导的凋亡

魏阳河等。自噬. 2012年12月.

.2012年12月；8(12):1811-21.

doi:10.4161/auto.22145。 Epub 2012年10月10日。

作者

魏阳河¹, 王琼（音）, 詹宁斯·徐, 徐秀玲, 梅贝尔·T·帕迪拉, 任国盛, 新沟, 永林

附属

¹重庆医科大学第一附属医院泌尿科，重庆，中国。

PMID： 23051914
预防性维修识别码：项目经理3541290
DOI（操作界面）： 10.4161/自动22145

摘要

虽然已知肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNFSF10/TRAIL）诱导自噬，但TNFSF10激活自噬的机制仍不清楚。在本报告中，我们证明TRAF2和RIPK1介导的MAPK8/JNK激活是TNFSF10诱导细胞保护性自噬所必需的。TNFSF10在来自肺、膀胱和前列腺肿瘤的癌细胞系中快速激活自噬。以关键自噬因子BECN1/Beclin 1或ATG7为靶点的药物抑制剂或siRNAs阻断自噬，可有效增强TNFSF10诱导的凋亡细胞毒性，证实TNFSF10-诱导的自噬具有细胞保护作用。阻断MAPK8而非NFκB有效地阻断了自噬，表明MAPK8是TNFSF10诱导自噬的主要途径。此外，阻断MAPK8可有效抑制BCL2L1/Bcl-xL的降解，并减少抑制自噬的BCL2L1-BECN1复合物。敲除TRAF2或RIPK1可有效抑制TNFSF10诱导的MAPK8活化和自噬。此外，抑制自噬抑制抗凋亡因子BIRC2/cIAP1、BIRC3/cIAP2、XIAP和CFLAR/c-FLIP的表达，并增加TNFSF10诱导的死亡诱导信号复合物（DISC）的形成。这些结果揭示了MAPK8激活途径通过TRAF2和RIPK1在TNFSF10诱导的自噬中的关键作用，该自噬可钝化癌细胞的凋亡。因此，抑制MAPK8介导的自噬可用于肿瘤细胞对TNFSF10治疗的敏化。

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数字

**图1。**TNFSF10在癌细胞中诱导自噬。(**A和B**)用TNFSF10处理细胞（UM-UC-3200 ng/ml用于A549，150 ng/ml用来PC-3）指定时间。western blot检测所示蛋白。ACTB被检测为负载控制。(**C和D**)用氯喹（CQ，20μM）预处理细胞30 min，然后用TNFSF10（UM-UC-3为60 ng/ml，A549为200 ng/ml）再处理2 h（MAP1LC3B）和8 h（SQSTM1）。western blot检测所示蛋白。ACTB被检测为负载控制。(E类)稳定转染GFP-LC3的A549用TNFSF10（200 ng/ml）处理1小时或保持未处理状态。照片是在荧光显微镜下拍摄的。(F类)用GFP-LC3点（左）和每个阳性细胞的点数量量化细胞数量。所示数据为平均值±标准差*p<0.01

**图2。**自噬保护癌细胞免受TNFSF10诱导的细胞毒性。(**A和B**)用3MA（10 mM）、CQ（20μM）或沃特曼（1μM）预处理细胞30 min，然后用TNFSF10（UM-UC-3为60 ng/ml，A549为200 ng/ml）处理细胞24 h。通过LDH释放试验测定细胞死亡。(C类)用不同抑制剂（CQ，20μM；沃特曼，1μM；3MA，10 mM）预处理UM-UC-3细胞30 min，然后分别用TNFSF10（60 ng/ml）再处理2 h（MAP1LC3B）和8 h（SQSTM1）。western blot检测所示蛋白。ACTB被检测为负载控制。(D类)用指示的siRNAs（10 nM）转染上层UM-UC-3细胞24 h，然后用TNFSF10（60 ng/ml）再处理24 h。通过LDH释放试验检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准差*p<0.01。用指示的siRNAs（10 nM）转染低级UM-UC-3细胞24小时。通过western blot检测指示的蛋白质。(E类)用指示的siRNAs（10 nM）转染UM-UC-3细胞24小时，然后用TNFSF10（60 ng/ml）再处理2小时（MAP1LC3B）和8小时（SQSTM1）。western blot检测所示蛋白。ACTB被检测为负载控制。

**图3。**自噬抑制TNFSF10诱导的凋亡信号。(**A和B**)用沃特曼（1μM）预处理UM-UC-3和A549细胞30 min，然后用TNFSF10（UM-UC-3为60 ng/ml，A549为200 ng/ml）再处理4 h。用western blot检测CASP8、CASP3和PARP1。GADPH被检测为负载控制。(**C和D**)通过GST下拉分析检测DISC形成。用CQ（20μM）预处理细胞30分钟，然后用GST-TNFSF10（A549为60 ng/ml和200 ng/ml）处理15分钟或不处理。将GST-TNFSF10（60 ng/ml）添加到来自未刺激细胞的裂解物中，以沉淀未刺激的TNFSF10-受体。通过western blot分析GST-TNFSF10结合蛋白是否存在TNFRSF10B、FADD和CASP8。检测GADPH作为负荷和阴性对照。

**图4。**抑制MAPK8活化可抑制TNFSF10诱导的自噬并增强TNFSF10-的细胞毒性。(**A和B**)用指示的抑制剂（SP600125，10μM；IKB抑制剂，50μM）预处理UM-UC-3和A549细胞30分钟，然后用TNFSF10（UM-UC-3为60 ng/ml，A549为200 ng/ml）再处理1小时。用western blot检测磷酸化MAPK8和MAP1LC3B。ACTB被检测为负载控制。(**C和D**)用SP600125（10μM）预处理UM-UC-3和A549细胞30分钟，然后用TNFSF10（UM-UC-3为60 ng/ml，A549为200 ng/ml）再处理24小时。通过LDH释放测定检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准差*p<0.01。(E类). 用SP600125（10μM）预处理UM-UC-3细胞30 min，然后用TNFSF10（60 ng/ml）再处理4 h。用western blot检测CASP8和PARP1。ACTB被检测为负载控制。

**图5。**MAPK8通过BCL2L1的降解和BCL2L1-BECN1复合物的分离介导自噬。(A类)A549细胞用TNFSF10（200 ng/ml）处理指定时间。western blot检测蛋白表达。GADPH被检测为负载控制。(B类)用指示的抑制剂（SP600125，10μM；IKBKB抑制剂，50μM）预处理A549细胞30 min，然后用TNFSF10（200 ng/ml）再处理1 h。用western blot检测BCL2L1和BCL2。GADPH被检测为负载控制。(C类)A549细胞用TNFSF10（200 ng/ml）处理指定时间（h）。与BECN1抗体共免疫沉淀后，用western blot检测蛋白。(D类)A549细胞用SP600125（10μM）预处理30 min或未处理，然后用TNFSF10（200 ng/ml）处理1 h。用BECN1抗体共免疫沉淀后，用western blot检测指示蛋白。GAPDH被检测为负载控制。

**图6。**MAPK8介导抗凋亡蛋白的自噬相关降解。(**A–C**)用指示的抑制剂（SP600125，10μM；沃特曼，1μM；MG132，10μM；组织蛋白酶B抑制剂，10μL；CQ，20μM；z-VAD，10μG）预处理UM-UC-3和A549细胞30 min，然后用TNFSF10（UM-UC-3为60 ng/ml，A549为200 ng/ml）再处理4 h。用western blot检测指示的蛋白质。ACTB被检测为负载控制。

**图7。**RIPK1和TRAF2调节TNFSF10诱导的自噬和MAPK8介导的自噬。(**A和B**)用阴性对照或siRNAs转染UM-UC-3细胞*RIPK1段*或*TRAF2型*.转染后2小时，用TNFSF10（60 ng/ml）处理细胞2小时（MAP1LC3B）和8小时（SQSTM1）。western blot检测所示蛋白。GAPDH被检测为负载控制。(**C和D**)用指示的siRNAs转染UM-UC-3和A549细胞24小时，然后用TNFSF10（UM-UC-2为60 ng/ml，A549为200 ng/ml）再处理24小时。通过LDH释放试验检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准差*p<0.01。(**E和F**)用指示的siRNAs（10 nM）转染UM-UC-3和A549细胞24小时。通过western blot检测指示的蛋白质。ACTB被检测为负载控制。

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