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.2012年9月；8（9）：e1002964。
doi:10.1371/journal.pgen.1002964。 Epub 2012年9月27日。

UTX和UTY在小鼠胚胎发育中显示组蛋白去甲基化酶依赖性功能

卡尔·B·施帕格尔 1, 仙谷彻, 横山由纪夫, 特里·马格努森
附属公司

UTX和UTY在小鼠胚胎发育中显示组蛋白去甲基化酶依赖性功能

卡尔·施帕格尔等。 公共科学图书馆-基因. 2012年9月.

摘要

UTX（KDM6A）和UTY是组蛋白H3赖氨酸27（H3K27）脱甲基酶基因家族的同源X和Y染色体成员。UTX能去甲基化H3K27；然而，体外试验表明，人类UTY由于序列差异而失去了酶活性。我们在Utx和Uty中都产生了小鼠突变。纯合子Utx突变女性胚胎是妊娠中期致命的胚胎，在神经管、卵黄囊和心脏发育方面存在缺陷。我们证明小鼠UTY缺乏体内去甲基化酶活性，因此半合子X（Utx-）Y（+）突变雄性胚胎应该对纯合X（Utx-）X（Utx-）雌性进行表型复制。然而，X（Utx-）Y（+）突变雄性胚胎发育到足月；尽管被断奶，但大约25%的婴儿在出生后仍能存活到成年。半合子X（+）Y（Uty-）突变雄性是可行的。相反，复合半合子X（Utx-）Y（Uty-）雄性表现为纯合X（Utx-）X（Utex-）雌性。因此，尽管UTX和UTY在催化H3K27去甲基化方面存在分歧，但它们在胚胎发育期间保持功能冗余。我们的数据表明，UTX和UTY能够通过去甲基化酶独立机制调节基因活性。我们得出结论，UTX H3K27去甲基化对胚胎生存能力来说是不必要的。

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数字

图1
图1。Utx公司突变等位基因。
（A） 小鼠突变的示意图Utx公司包括蛋白质突变的注释和位置。两个Utx公司突变等位基因包括内含子3（X）中的基因陷阱UtxGT1型)和基因陷阱/漂浮外显子3（XUtxGT2fl公司)。UTX蛋白注释显示在顶部，以指示Utx公司等位基因。一个种系Cre重组酶删除了X中的外显子3UtxGT2fl公司创建X的背景UtxGT2Δ此外，X的基因陷阱UtxGT2fl公司用Flp重组酶切除以产生标准的漂浮外显子3（XUtxfl公司)Cre重组产生了XUtxΔ（B）E18.5肝脏的蛋白质印迹显示X中UTX完全缺失UtxGT1型年尤蒂+裂解物。RbBP5用作加载控制。（C） E10.5全胚胎的蛋白质印迹显示X中UTX完全缺失UtxΔ年乌蒂+和XUtxΔX（X）UtxΔ裂解物。RbBP5用作加载控制。（D） E12.5初级MEF的Western blotting显示X中UTX减少UtxGT2fl公司年尤蒂+和XUtxGT2fl公司X（X）UtxGT2fl公司裂解物。RbBP5用作加载控制。
图2
图2。半合子男性Utx公司突变小鼠被处死。
（A） 半合子男性Utx公司突变体小鼠大小适中。野生型公XUtx公司 +年+小鼠被展示在半合子X旁边UtxGT1型年+老鼠。（B） 半合子小鼠在整个成年期体型较小。
图3
图3。纯合子女性Utx公司突变胚胎具有中期妊娠发育延迟。
（A） 与对照组（A-i和A-v）相比，纯合雌性E10.5 XUtxGT1型X（X）UtxGT1型（A-ii）和XUtxGT2ΔX（X）UtxGT2Δ（A-vi）胚胎有一些发育延迟，包括体积较小、心脏发育不全（白色箭头）和头部神经管开放（箭头）。更严重的胚胎与E9.5胚胎的大小和特征相似，心脏异常和心周水肿（A-iii，vii，红色箭头）。半合子男性XUtxGT1型年尤蒂+胚胎在此阶段（A-iv）表现正常。X轴UtxGT1型和XUtxGT2Δ等位基因不能作为女性X互补UtxGT1型X（X）UtxGT2Δ胚胎与纯合子（A-viii）具有相同的表型。（B） E10.5处，纯合XUtxGT1型X（X）UtxGT1型雌性胚胎的卵黄囊血管系统正常，红细胞减少（B-ii），或卵黄囊完全苍白，血管丛未成形（B-iii）。
图4
图4。UTX和UTY在胚胎发育中具有基本的冗余功能。
（A） 小鼠突变示意图尤蒂. The尤蒂基因陷阱YUtyGT公司位于内含子4中。顶部的蛋白质注释表示基因陷阱在尤蒂编码序列。（B） X尾部RNA基因陷阱（外显子15）下游的定量RT-PCR+年UtyGT公司小鼠基本上没有表现出突变RNA。（C）XUtxGT2Δ年UtyGT公司雄性（C-iii，iv）与X具有相同的表型UtxGT2ΔX（X）UtxGT2Δ雌性（图3A-vi，vii）。箭头表示头部开放的神经管，而白色和红色箭头表示中度和更严重的心脏表型。
图5
图5。UTX和UTY冗余对心脏发育的进展至关重要。
（A） 大小相似Utx公司杂合（i），Utx公司纯合子（ii），Utx公司半合子（iii），或发送（Utx/U）对复合半合子（iv）胚胎心脏发育异常进行了更详细的分析。这些胚胎各自心脏的正面视图显示Utx公司纯合子和发送（Utx/U）复合半合子（A-vi，viii）的心脏较小，相对于Utx公司杂合子（A-v）或半合子（A-vii）。在所有面板中以相同的角度绘制了一条白色虚线，以说明心脏无法与该适当平面对齐。仅控制和Utx公司半合子胚胎（A-v，vii）已开始形成室间隔沟（白色箭头），表明室间隔早期发育。（B） E10.5 X的横截面UtxGT2ΔX（X）UtxGT2Δ（B-ii）和XUtxGT2Δ年UtyGT公司（B-iv）胚胎显示心脏较小，心室心肌小梁和组织缺陷。控制和Utx公司半合子心脏开始形成室间隔（B-i，iii，IVS，黑色箭头），而其他突变组合（B-ii，iv）没有（红色星号）。RA和LA=右心房和左心房，RV和LV=右心室和左心室。（C） 更放大的图像进一步说明了心室壁的狭窄（红色刻度）以及心肌细胞和结构的缺乏Utx公司纯合子和发送（Utx/U）复合半合子（Epi=心外膜，MC=心肌，Endo=心内膜）。
图6
图6。人和小鼠UTY没有H3K27脱甲基酶活性。
（A） 用标记的人类（H）和小鼠（M）UTX和UTY构建物转染HEK293T细胞。C末端片段跨越人类UTX中的AA 880–1401（图S6），并包括小鼠UTX中相应的区域。过度表达H-UTX和M-UTX（标记免疫荧光，绿色假彩色）的转染细胞（白色箭头）显示H3K27me3免疫荧光（红色假彩色）整体丢失。转染H-UTY和M-UTY C末端结构的细胞没有去甲基化H3K27me3。（B） UTX和UTY突变结构体的H3K27me3脱甲基酶检测。H-UTX H1146A在之前报告的H3K27脱甲基缺陷残基中包含一个点突变。表达H-UTX H1146A的细胞没有丢失H3K27me3。小鼠UTY有一个Y到C的氨基酸变化，对应于人类UTX中的1135位。预计UTX残基会调节H3K27me3结合和去甲基化。H-UTX Y1135C的表达未能去甲基化H3K27me3。小鼠UTY也有一个T到I的氨基酸变化，对应于人类UTX中的1143位，预计该位置会调节脱甲基酶反应中酮戊二酸的结合。H-UTX T1143I的表达未能去甲基化H3K27me3。修正小鼠Uty（M-Uty-C947Y，I955T）中这两个改变的残基未能恢复H3K27me3脱甲基酶活性。（C） 人/鼠UTX人UTY、鼠UTY和人/鼠JMJD3的JmjC域对齐。UTY非保守替代物用白色方框表示，感兴趣的剩余物用红色星号标记。分析的UTX突变列在比对的上方，而JMJD3突变列在校准的下方。（D） HEK293T细胞转染C末端UTX和UTY结构体或携带各种AA替代物的全长小鼠JMJD3结构体。与附近未转染细胞相比，H3K27me3水平明显降低，对中高表达细胞（每次实验得分N≥100个细胞）进行评分。100%的表达WT H-UTX、M-UTX和M-JMJD3的细胞具有可观察到的H3K27me3去甲基化。删除JmjC结构域的H-UTX H1146A、M-JMJD3 H1388A和M-JMJD2的阴性对照没有可见的H3K27me3去甲基化（0%的细胞）。野生型H-UTY和M-UTY有0%的细胞具有可检测的去甲基化。在预测影响H3K27me3的UTY点突变中，只有H-UTX Y1135C和T1143I的突变与相应的M-JMJD3 Y1377C和T1385I没有任何可检测到的H3K27去甲基化的细胞（0%）。（E） 人类UTX活性部位立体图（PDB ID:3AVR）。小鼠UTY中的相应残基也显示在括号中。该图由Pymol（Schrodinger LLC）程序编制。
图7
图7。UTX和UTY在常见的蛋白质复合物中结合，并且能够进行H3K27脱甲基酶非依赖性基因调控。
（A） HA-UTX与Flag-UTX或Flag-UTIY的共转染表明HA-UTX可以与Flag-UTX和Flag-UITY免疫沉淀。（B） Flag UTX和Flag UTY的免疫沉淀揭示了与RBBP5的相互作用，RBBP5是H3K4甲基转移酶复合物的一种成分。标记载体转染用作免疫沉淀的阴性对照。（C）Fnbp1型是UTX直接靶向的基因，在X中具有中间下调乌特克斯−年尤蒂+MEF（68%的WT，t检验p值=0.002），但在X中进一步受损乌特克斯−X（X）乌特克斯−（重量的42%，相对于X的t检验p值乌特克斯−年尤蒂+=================================================================0.001）和X乌特克斯−年乌蒂−（WT的48%，相对于X的t检验p值乌特克斯−年尤蒂+=================================================================0.02，每个基因型N>4个独立的MEF系）MEF。MEF由X生成UtxGT2Δ和YUtyGT公司等位基因。（D）Fnbp1型同样在X中表达错误UtxGT2fl公司E12.5等位基因组合。X（X）乌特克斯−X（X）乌特克斯−和X乌特克斯−年乌蒂−MEF与X显著不同乌特克斯−年尤蒂+MEF（t检验p值分别为0.05和0.02，每个基因型N>4个独立的MEF系）。（E） 在E12.5 X上执行H3K27me3 ChIPUtx公司+年乌蒂+控制（绿色）和X乌特克斯−X（X）乌特克斯−（红色）MEF。IgG抗体对照以灰色表示。对阴性对照区（基因间区）和阳性对照区进行ChIP定量PCR(HoxB1型).Fnbp1型无法在X中累积H3K27me3乌特克斯−X（X）乌特克斯−MEF（t检验p值=0.5，N=每个基因型4个独立的MEF系）。（F） 在E12.5 X上执行H3K4me3 ChIPUtx公司+年尤蒂+控制（绿色）和X乌特克斯−X（X）乌特克斯−（红色）MEF。IgG抗体对照以灰色表示。对阴性对照区（基因间区）和阳性对照区进行ChIP定量PCR(Npm1号机组)。WT公司Fnbp1型启动子表现出显著的H3K4me3积累，在X乌特克斯−X（X）乌特克斯−MEF（t检验p值=0.005，每个基因型3个独立的MEF系）。
图8
图8。UTY与BRG1和心脏转录因子相关，并调节下游ANF基因表达。
（A） Myc-UTY与Flag载体对照或Flag BRG1联合转染，并用Flag-Agarose珠免疫沉淀。带有Flag-BRG1的Myc-UTY特异性免疫沉淀。（B） Myc-UTY与Flag载体对照或Flag-NKX2-5联合转染。Myc-UTY由Flag-NKX2-5联合免疫沉淀。（C） ANF：荧光素酶报告试验。HEK293T转染了报告人ANF:Luciferase结构体（-）、NKX2-5、NKX2-5和UTY或NKX2-5和UTX。报告活性随着UTY的加入而显著增强（t检验p值=0.01）。右面板显示了UTY与UTX增强NKX2–5驱动的ANF表达的比较。N=每组3次独立转染。（D）安福从E10.5心脏RT-PCR分析不同XUtxGT2Δ和YUtyGT公司等位基因组合。在X中观察到ANF适度但不显著的下调乌特克斯−年尤蒂+心脏（76%的WT，t检验p值=0.06），但在X乌特克斯−X（X）乌特克斯−（WT的52%，相对于X的t检验p值Utx公司+年尤蒂+=================================================================0.005）和X乌特克斯−年乌蒂−（WT的57%，相对于X的t检验p值Utx公司+年尤蒂+=================================================================0.02，每个基因型N>4）心脏。
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