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.2012年11月9日；287(46):39115-24.
doi:10.1074/jbc。M112.409581。 Epub 2012年9月20日。

CXCL12/CXCR4蛋白信号转导轴通过细胞外调节激酶和Akt激酶介导的核因子κB活化诱导胰腺癌细胞中的声音刺猬表达：对双向肿瘤-基质相互作用的影响

阿杰·辛格 1, 苏米特·阿罗拉, 阿伦·巴德瓦吉, Sanjeev K Srivastava公司, 马达维·P·卡达克亚, Bin Wang（王斌）, 威廉·格里斯, 劳里·B·欧文, 西玛·辛格
附属公司

CXCL12/CXCR4蛋白信号转导轴通过细胞外调节激酶和Akt激酶介导的核因子κB活化诱导胰腺癌细胞中的声音刺猬表达：对双向肿瘤-基质相互作用的影响

阿杰·辛格等。 生物化学杂志. .

摘要

最近的证据表明肿瘤-基质相互作用在胰腺癌病理生物学中起着重要作用。由基质细胞大量产生的趋化因子CXCL12（基质细胞衍生因子1（SDF-1））可促进胰腺癌细胞的进展、转移和化疗抵抗。另一方面，胰腺肿瘤细胞衍生的声波刺猬（SHH）主要作用于基质细胞，诱导结缔组织增生，因此对肿瘤发生和治疗结果具有旁分泌作用。在这项研究中，我们检测了这两种蛋白在胰腺癌中的病理意义。我们的数据表明，CXCL12导致胰腺癌细胞中SHH的剂量和时间依赖性上调。CXCL12诱导的SHH上调是通过受体CXCR4特异性介导的，并且依赖于下游Akt和ERK信号通路的激活。Akt和ERK通过诱导其抑制蛋白IκB-α的磷酸化和失稳，共同促进NF-κB的核积累。使用显性阴性IκB-α、SHH启动子（缺失突变）报告子和染色质免疫沉淀分析，我们证明CXCL12暴露增强了NF-κB与SHH启动因子的直接结合，并且抑制NF-kb B激活可消除CXCL12诱导的SHH表达。最后，我们的数据表明，CXCR4和SHH在人类胰腺癌组织中的表达具有很强的相关性，而在正常胰腺中未观察到它们的表达。总之，我们的数据揭示了胰腺癌中SHH异常表达的新机制，并确定了促进肿瘤-基质双向相互作用的分子联系。

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数字

图1。
图1。
CXCL12诱导人胰腺癌细胞SHH的表达。用不同剂量的CXCL12（0–200 ng/ml）处理6孔板中未充分生长的胰腺癌细胞24小时(一个)或在指定的（0–48小时）时间间隔内使用恒定剂量（100 ng/ml）的CXCL12(B类). 提取总RNA和蛋白质，分别通过定量RT-PCR和免疫印迹分析检测SHH的表达。采用GAPDH（定量RT-PCR）和β-肌动蛋白（免疫印迹分析）作为内部对照。CXCL12在转录和蛋白质水平诱导SHH的剂量和时间依赖性表达。误差线表示三倍±S.D.*的平均值，第页< 0.05; **,第页< 0.01.
图2。
图2。
CXCL12诱导的SHH表达是通过胰腺癌细胞中的CXCR4介导的。用非靶标瞬时转染MiaPaCa和Colo357细胞(NT公司)或CXCR4和CXCR7靶向的siRNA。转染24小时后，用CXCL12（100 ng/ml）处理细胞，再持续24小时。分离总蛋白并进行免疫印迹分析，以评估CXCR4、CXCR7和SHH的表达。β-actin作为内部对照。数据表明靶向特异性siRNAs可特异性沉默CXCR4和CXCR7，并清楚地证明CXCL12诱导的SHH表达是通过胰腺癌细胞中的CXCR4特异性介导的。
图3。
图3。
CXCL12诱导的胰腺癌细胞SHH表达依赖于Akt和ERK的下游激活。用Akt抑制剂预处理胰腺癌细胞（MiaPaCa和Colo357）(LY294002型, 20 μ米)或ERK抑制剂(PD98059型, 25 μ米)1 h，然后用CXCL12（100 ng/ml）治疗15 min或24 h。分离总蛋白，并用免疫印迹分析检测Akt、p-Akt，ERK、p-ERK（CXCL12暴露15 min后）和SHH（暴露24 h后）的表达。β-actin作为负荷对照。数据表明抑制剂的选择性功效，并证明CXCL12暴露后SHH的诱导是通过Akt和ERK途径实现的。
图4。
图4。
CXCL12诱导的Akt和ERK的激活促进胰腺癌细胞核聚积和NF-κB的转录活性。 一个，胰腺癌细胞用Akt抑制剂预处理(LY294002型, 20 μ米)或ERK抑制剂(第98059页, 25 μ米)1小时，然后用CXCL12（100 ng/ml）治疗。总计，核能(Nuc（数字）)和细胞质(细胞)在CXCL12治疗8小时后制备提取物，以检查对NF-κB/p65、p-IκB-α和IκBα的影响。通过免疫印迹分析检测对各种蛋白质的影响。层粘连蛋白（核组分）和α-微管蛋白（细胞质组分）用作负荷对照。B类，将细胞与NF-κB反应性或对照报告质粒瞬时共转染24 h。随后，用Akt和ERK抑制剂对细胞进行预处理（1 h），并用CXCL12刺激细胞24 h雷尼利亚检测处理细胞中荧光素酶的活性，以分别测量NF-κB转录活性和转染效率。数据以归一化荧光素酶单位（萤火虫/雷尼利亚荧光素酶）。误差线表示三倍±S.D.*的平均值，第页≤ 0.01.
图5。
图5。
抑制NF-κB/p65激活可消除CXCL12诱导的胰腺癌细胞SHH表达。将IκB-α野生型或IκBα突变质粒转染在6孔板中生长到亚融合状态的胰腺癌细胞。24小时后，用CXCL12（100 ng/ml）处理细胞8小时（针对NF-κB、IκB-α和p-IκB-α）和24小时（针对SHH）。总计，核能(Nuc（数字）)和细胞质(细胞)制备提取物，并对NF-κB/p65、p-IκB-α（S32/36）和IκBα的影响(一个)和SHH(B类)通过免疫印迹分析测定。层粘连蛋白（核组分）、α-管蛋白（细胞质组分）和β-肌动蛋白（总蛋白）用作负荷对照。
图6。
图6。
NF-κB与SHH启动子的直接结合对于CXCL12诱导SHH表达至关重要。 一个，胰腺癌细胞与含有SHH启动子缺失突变体下游萤火虫荧光素酶基因的质粒和对照质粒共转染雷尼利亚荧光素酶质粒。转染24小时后，用CXCL12（100 ng/ml）再处理细胞24小时雷尼利亚分析荧光素酶活性，并将数据表示为相对于未处理细胞的标准化倍数差异（平均值±S.D。；n个= 3; *,第页≤0.01）。B类，SHH启动子区域（-1至−102）包含NF-κB结合位点，描述了ChIP分析中使用的引物的序列和位置。C类用CXCL12（100 ng/ml）处理胰腺癌细胞，并用甲醛交联蛋白质和DNA。交叉连接的染色质被剪切并免疫沉淀(IP（IP）)抗NF-κB/p65或非特异性IgG。免疫沉淀染色质用SHH启动子特异性引物进行PCR扩增，扩增产物通过电泳进行解析。
图7。
图7。
胰腺癌组织中CXCR4和SHH的表达相关。 一个在正常人中检测CXCR4、CXCR7和SHH的表达(N1-N7号)和胰腺癌(C1-C21号机组)蛋白质水平的组织通过Western blot分析。正常胰腺样本中没有CXCR4或SHH的表达，而在7个正常组织中有2个检测到CXCR7的低表达。在大多数或所有胰腺癌组织中检测到CXCR4、SHH和CXCR7的可变表达（从低到高）。β-actin作为负荷对照。B类用密度法定量免疫反应条带的强度。对CXCR4、CXCR7和SHH表达的归一化密度测定值进行皮尔逊相关系数（R）分析。我们的分析表明CXCR4和SHH之间有很强的相关性(第页=0.863，第页<0.0001），而CXCR7和SHH之间没有显著相关性(第页= 0.16,第页= 0.4889).
图8。
图8。
CXCL12/CXCR4与刺猬途径旁分泌相互作用的拟议分子模型。基质细胞分泌的CXCL12与胰腺癌细胞上的受体CXCR4结合。由此启动的下游信号导致Akt和ERK激活，导致IκB-α磷酸化和失稳。因此，NF-κB在细胞核中释放和积累。核NF-κB直接结合SHH启动子并诱导SHH表达。该模型建立了Akt/ERK-IKK-IkB-NF-κB级联在CXCL12诱导SHH表达中的作用。
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