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.2013年2月；57(2):656-66.
doi:10.1002/hep.26019。

G-蛋白偶联胆汁酸受体Gpbar1（TGR5）缺乏增强化学诱导的肝癌发生

陈伟东 1, 唐娜·余（Donna Yu）, 巴里·福曼, 黄文东, 王延东
附属公司

G-蛋白偶联胆汁酸受体Gpbar1（TGR5）缺乏增强化学诱导的肝癌发生

陈伟东等。 肝病学. 2013年2月.

缩回

摘要

Gpbar1（TGR5）是一种膜结合胆汁酸受体，因其在调节能量稳态和葡萄糖代谢中的作用而广为人知。TGR5激活也抑制核因子κB（NF-κB）介导的炎症。在这里，我们表明TGR5缺乏增强了化学诱导的肝癌发生，TGR5是信号转导和转录激活因子3（STAT3）信号的负调控因子。缺乏TGR5的小鼠比野生型（WT）小鼠更容易受到二乙基亚硝胺（DEN）诱导的急性肝损伤和肝癌发生的影响。与TGR5（-/-）小鼠肝癌发病率的增加相一致，在缺乏TGR5信号的情况下，肝细胞死亡、代偿性增殖以及某些炎症细胞因子和基质金属蛋白酶的基因表达对DEN诱导更为敏感。在体外，TGR5的激活大大抑制了人肝癌细胞的增殖和迁移。然后我们发现TGR5激活在体内外强烈抑制STAT3信号传导。此外，我们观察到TGR5通过抑制STAT3磷酸化、其转录活性和DNA结合活性来拮抗STAT3通路，这表明TGR5至少部分通过抑制STAT_3信号来拮抗肝脏肿瘤的发生。

结论：这些发现表明TGR5是一种新型的肝癌抑制因子，可能是一种有吸引力的治疗人类肝癌的工具。

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图1
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TGR5型−/−小鼠肝脏对DEN诱导的急性肝损伤更敏感。（A） WT和TGR5血清中炎症血清标志物和ALT的水平−/−（TGR5KO）小鼠，以100 mg/kg体重（n=4–5）的剂量服用载体（0.9%NaCl）或DEN*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.005. （B） TGR5中对DEN反应的促炎基因表达诱导作用显著增强−/−小鼠比WT小鼠（n=4-5）*P（P）与同一时间点的WT小鼠相比，<0.05。（C） WT和TGR5切片的代表性Ki67染色−/−肝脏（放大倍率，×200）和每个场Ki67阳性细胞数的统计分析。箭头表示Ki67阳性细胞。计算了20个微观区域*P（P）与WT组相比，<0.05（n=4-5）。
图1
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TGR5型−/−小鼠肝脏对DEN诱导的急性肝损伤更敏感。（A） WT和TGR5血清中炎症血清标志物和ALT的水平−/−（TGR5KO）小鼠，以100 mg/kg体重（n=4–5）的剂量服用载体（0.9%NaCl）或DEN*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.005. （B） TGR5中对DEN反应的促炎基因表达诱导作用显著增强−/−小鼠比WT小鼠（n=4-5）*P（P）与同一时间点的WT小鼠相比，<0.05。（C） WT和TGR5切片的代表性Ki67染色−/−肝脏（放大倍率，×200）和每个场Ki67阳性细胞数的统计分析。箭头表示Ki67阳性细胞。计算了20个微观区域*P（P）与WT组相比，<0.05（n=4-5）。
图1
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TGR5型−/−小鼠肝脏对DEN诱导的急性肝损伤更敏感。（A） WT和TGR5血清中炎症血清标志物和ALT的水平−/−（TGR5KO）小鼠，用载体（0.9%NaCl）或DEN以100 mg/kg体重处理（n=4–5）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.005. （B） TGR5中对DEN反应的促炎基因表达诱导作用显著增强−/−小鼠比WT小鼠（n=4-5）*P（P）与同一时间点的WT小鼠相比，<0.05。（C） WT和TGR5切片的代表性Ki67染色−/−肝脏（放大倍率，×200）和每个场Ki67阳性细胞数的统计分析。箭头表示Ki67阳性细胞。计算了20个微观区域*P（P）与WT组相比，<0.05（n=4–5）。
图2
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TGR5缺乏可促进DEN诱导的肝癌。（A） TGR5型−/−出生后26天，DEN治疗8个月后，小鼠发生肿瘤（n=24）。箭头表示肿瘤。（B） 肝脏切片的代表性H&E染色和WT和TGR5的ALT水平−/−DEN治疗8个月后的小鼠（n=24）。NT，非肿瘤；T、 肿瘤*P（P）< 0.05. 控制；DEN、DEN处理组。黑色箭头，胆管；白色箭头，炎性细胞；箭头，局部坏死。（C） WT和TGR5切片的代表性PCNA染色−/−肝脏（放大倍率，×200）和每个场PCNA阳性细胞数的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量。箭头表示PCNA阳性细胞*P（P）< 0.05. （D） 每个场Ki67阳性细胞数的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量*P（P）< 0.05. （E） WT和TGR5切片的代表性TUNEL染色−/−肝脏（放大倍率，×200）和每个场TUNEL阳性细胞数的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量*P（P）< 0.05. （F） 基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶12在WT和TGR5中的基因表达−/−DEN给药后的肝脏*P（P）<0.05和**P（P）与对照组相比<0.05。
图2
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TGR5缺乏可促进DEN诱导的肝癌。（A） TGR5型−/−出生后26天，DEN治疗8个月后，小鼠发生肿瘤（n=24）。箭头表示肿瘤。（B） 肝切片的代表性H&E染色以及WT和TGR5的ALT水平−/−DEN治疗8个月后的小鼠（n=24）。NT，非肿瘤；T、 肿瘤*P（P）< 0.05. 控制；DEN、DEN处理组。黑色箭头，胆管；白色箭头，炎症细胞；箭头，局部坏死。（C） WT和TGR5切片的代表性PCNA染色−/−肝脏（放大倍率，×200）和每个场PCNA阳性细胞数的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量。箭头表示PCNA阳性细胞*P（P）< 0.05. （D） 每个场Ki67阳性细胞数的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量*P（P）< 0.05. （E） WT和TGR5切片的代表性TUNEL染色−/−肝脏（放大倍率，×200）和每个场TUNEL阳性细胞数的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量*P（P）< 0.05. （F） 基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶12在WT和TGR5中的基因表达−/−DEN给药后的肝脏*P（P）<0.05和**P（P）与对照组相比，<0.05。
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TGR5缺乏可促进DEN诱导的肝癌。（A） TGR5型−/−出生后26天，DEN治疗8个月后，小鼠发生肿瘤（n=24）。箭头表示肿瘤。（B） 肝切片的代表性H&E染色以及WT和TGR5的ALT水平−/−DEN治疗8个月后的小鼠（n=24）。NT，非肿瘤；T、 肿瘤*P（P）< 0.05. 控制；DEN、DEN处理组。黑色箭头，胆管；白色箭头，炎性细胞；箭头，局部坏死。（C） WT和TGR5切片的代表性PCNA染色−/−肝脏（放大倍数，×200）和每个视野中PCNA阳性细胞数量的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量。箭头表示PCNA阳性细胞*P（P）< 0.05. （D） 每个场Ki67阳性细胞数的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量*P（P）< 0.05. （E） WT和TGR5切片的代表性TUNEL染色−/−肝脏（放大倍数，×200）和每视野TUNEL阳性细胞数量的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量*P（P）< 0.05. （F） 基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶12在WT和TGR5中的基因表达−/−DEN给药后的肝脏*P（P）<0.05和**P（P）与对照组相比，<0.05。
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TGR5缺乏可促进DEN诱导的肝癌。（A） TGR5型−/−出生后26天，DEN治疗8个月后，小鼠发生肿瘤（n=24）。箭头表示肿瘤。（B） 肝脏切片的代表性H&E染色和WT和TGR5的ALT水平−/−DEN治疗8个月后的小鼠（n=24）。NT，非肿瘤；T、 肿瘤*P（P）< 0.05. 控制；DEN、DEN处理组。黑色箭头，胆管；白色箭头，炎性细胞；箭头，局部坏死。（C） WT和TGR5切片的代表性PCNA染色−/−肝脏（放大倍数，×200）和每个视野中PCNA阳性细胞数量的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量。箭头表示PCNA阳性细胞*P（P）< 0.05. （D） 每个场Ki67阳性细胞数量的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量*P（P）< 0.05. （E） WT和TGR5切片的代表性TUNEL染色−/−肝脏（放大倍率，×200）和每个场TUNEL阳性细胞数的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量*P（P）< 0.05. （F） 基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶12在WT和TGR5中的基因表达−/−DEN给药后的肝脏*P（P）<0.05和**P（P）与对照组相比，<0.05。
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TGR5缺乏可促进DEN诱导的肝癌。（A） TGR5型−/−出生后26天，DEN治疗8个月后，小鼠发生肿瘤（n=24）。箭头表示肿瘤。（B） 肝脏切片的代表性H&E染色和WT和TGR5的ALT水平−/−DEN治疗8个月后的小鼠（n=24）。NT，非肿瘤；T、 肿瘤*P（P）< 0.05. 控制；DEN、DEN处理组。黑色箭头，胆管；白色箭头，炎性细胞；箭头，局部坏死。（C） WT和TGR5切片的代表性PCNA染色−/−肝脏（放大倍率，×200）和每个场PCNA阳性细胞数的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量。箭头表示PCNA阳性细胞*P（P）< 0.05. （D） 每个场Ki67阳性细胞数量的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量*P（P）< 0.05. （E） WT和TGR5切片的代表性TUNEL染色−/−肝脏（放大倍率，×200）和每个场TUNEL阳性细胞数的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量*P（P）< 0.05. （F） 基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶12在WT和TGR5中的基因表达−/−DEN给药后的肝脏*P（P）<0.05和**P（P）与对照组相比，<0.05。
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TGR5缺乏可促进DEN诱导的肝癌。（A） TGR5型−/−小鼠在出生后26天接受DEN治疗8个月后出现肿瘤（n=24）。箭头表示肿瘤。（B） 肝脏切片的代表性H&E染色和WT和TGR5的ALT水平−/−DEN治疗8个月后的小鼠（n=24）。NT，非肿瘤；T、 肿瘤*P（P）< 0.05. 控制；DEN、DEN治疗组。黑色箭头，胆管；白色箭头，炎性细胞；箭头，局部坏死。（C） WT和TGR5切片的代表性PCNA染色−/−肝脏（放大倍率，×200）和每个场PCNA阳性细胞数的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量。箭头表示PCNA阳性细胞*P（P）< 0.05. （D） 每个场Ki67阳性细胞数的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量*P（P）< 0.05. （E） WT和TGR5切片的代表性TUNEL染色−/−肝脏（放大倍率，×200）和每个场TUNEL阳性细胞数的统计分析。统计了至少20个显微镜视野中的细胞数量*P（P）< 0.05. （F） 基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶12在WT和TGR5中的基因表达−/−DEN给药后的肝脏*P（P）<0.05和**P（P）与对照组相比，<0.05。
图3
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TGR5激活会损害人肝癌细胞的增殖和迁移。（A） TGR5通过其配体激活抑制HepG2细胞的增殖。用MTT法分析细胞增殖。将TGR5质粒转染到HepG2细胞中，然后在24小时后将配体加入到培养物中。在治疗1、2和3天后，进行MTT分析以确定细胞增殖*P（P）与对照组相比，<0.05（n=3）。Con，控制。（B） 与对照组相比，经配体处理的TGR5转染细胞的划痕闭合率较低在体外划痕试验（n=3）。转染后2.5天记录伤口愈合情况。（C） Transwell细胞迁移实验证实TGR5激活抑制HepG2细胞迁移（n=3）*P（P）与对照组相比，<0.05。（D） TGR5的激活抑制了HepG2细胞中MMP7和MMP9的基因表达*P（P）与对照组相比，<0.05（n=3）。转染后2天测量mRNA水平。n=3是指三个独立的实验，每个实验一式三份。
图3
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TGR5激活会损害人肝癌细胞的增殖和迁移。（A） TGR5通过其配体激活抑制HepG2细胞的增殖。用MTT法分析细胞增殖。TGR5质粒转染HepG2细胞，24小时后加入配体。在治疗1、2和3天后，进行MTT分析以确定细胞增殖*P（P）与对照组相比，<0.05（n=3）。Con，控制。（B） 与对照组相比，经配体处理的TGR5转染细胞的划痕闭合率较低在体外划痕试验（n=3）。转染后2.5天记录伤口愈合情况。（C） Transwell细胞迁移实验证实TGR5激活抑制HepG2细胞迁移（n=3）*P（P）与对照组相比，<0.05。（D） TGR5激活抑制HepG2细胞中MMP7和MMP9的基因表达*P（P）与对照组相比，<0.05（n=3）。转染后2天测量mRNA水平。n=3是指三个独立的实验，每个实验一式三份。
图4
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TGR5抑制STAT3磷酸化在体外和体内（A）WT和TGR5总蛋白池中磷酸化STAT3（p-STAT3）和总STAT3的免疫印迹分析−/−DEN治疗8个月后的小鼠肝脏（n=24）。蛋白质印迹一式三份*P（P）< 0.05. （B） TGR5过表达和配体治疗抑制了IL-6诱导的HepG2细胞中的p-STAT3。用配体处理细胞18小时，然后用IL-6处理细胞2小时。（n=3）（A）和（B）中相对蛋白质水平的数据表示为对照组（车道1）中p-STAT3与T-STAT3比值的倍数变化。（C） WT和TGR5总蛋白池中p-STAT3和T-STAT3的免疫印迹分析−/−用或不用LPS处理的小鼠肝脏（三个独立实验，每组5-6只小鼠）。给小鼠喂食含有10毫克23（S）-mCDCA/kg的饮食或标准啮齿动物食物3天。禁食过夜后，用LPS（20 mg/kg）或PBS治疗小鼠6小时。
图4
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TGR5抑制STAT3磷酸化在体外和体内（A）WT和TGR5总蛋白池中磷酸化STAT3（p-STAT3）和总STAT3的免疫印迹分析−/−DEN治疗8个月后的小鼠肝脏（n=24）。Western blot检测一式三份*P（P）< 0.05. （B） 配体处理的TGR5过表达抑制了HepG2细胞中IL-6诱导的p-STAT3。用配体处理细胞18小时，然后用IL-6处理细胞2小时。（n=3）（A）和（B）中相对蛋白质水平的数据表示为对照组（车道1）中p-STAT3与T-STAT3比值的倍数变化。（C） WT和TGR5总蛋白池中p-STAT3和T-STAT3的免疫印迹分析−/−用或不用LPS处理的小鼠肝脏（三个独立实验，每组5-6只小鼠）。给小鼠喂食含有10毫克23（S）-mCDCA/kg的饮食或标准啮齿动物食物3天。禁食过夜后，用LPS（20 mg/kg）或PBS治疗小鼠6小时。
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TGR5抑制STAT3磷酸化在体外和体内（A）WT和TGR5总蛋白池中磷酸化STAT3（p-STAT3）和总STAT3的免疫印迹分析−/−DEN治疗8个月后的小鼠肝脏（n=24）。Western blot检测一式三份*P（P）< 0.05. （B） TGR5过表达和配体治疗抑制了IL-6诱导的HepG2细胞中的p-STAT3。用配体处理细胞18小时，然后用IL-6处理细胞2小时。（n=3）（A）和（B）中相对蛋白质水平的数据表示为对照组（车道1）中p-STAT3与T-STAT3比值的倍数变化。（C） WT和TGR5总蛋白池中p-STAT3和T-STAT3的免疫印迹分析−/−用或不用LPS处理的小鼠肝脏（三个独立实验，每组5-6只小鼠）。给小鼠喂食含有10毫克23（S）-mCDCA/kg的饮食或标准啮齿动物食物3天。禁食过夜后，用LPS（20 mg/kg）或PBS治疗小鼠6小时。
图5
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激活TGR5可拮抗STAT3的反式作用及其DNA结合活性。（A） TGR5以剂量依赖的方式抑制IL-6诱导的STAT3转录活性。HepG2细胞与STAT3报告质粒phRL-TK共转染，并以1:10、2:10、3:10或5:10的比例增加TGR5表达质粒的数量。在第三和第四列中使用相同剂量的TGR5质粒。转染后，用23（S）-mCDCA（10μM）或载体（DMSO）处理细胞18小时，然后用IL-6（20ng/mL）处理6小时*P（P）与IL-6治疗组相比<0.005。RLU，相对荧光素酶单位。（B） EMSA显示TGR5的激活抑制了LPS诱导的STAT3 DNA结合活性（n=5-6）。
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激活TGR5可拮抗STAT3的反式作用及其DNA结合活性。（A） TGR5以剂量依赖的方式抑制IL-6诱导的STAT3转录活性。HepG2细胞与STAT3报告质粒phRL-TK共转染，并以1:10、2:10、3:10或5:10的比例增加TGR5表达质粒的数量。在第三和第四列中使用相同剂量的TGR5质粒。转染后，用23（S）-mCDCA（10μM）或载体（DMSO）处理细胞18小时，然后用IL-6（20ng/mL）处理6小时*P（P）与IL-6治疗组相比<0.005。RLU，相对荧光素酶单位。（B） EMSA显示TGR5的激活抑制了LPS诱导的STAT3 DNA结合活性（n=5-6）。
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