Strategies of bacterial over expression of membrane transporters relevant in human health: the successful case of the three members of OCTN subfamily

doi:10.1007/s12033-012-9586-8

审查

.2013年6月；54(2):724-36.

doi:10.1007/s12033-012-9586-8。

细菌过度表达与人类健康相关的膜转运蛋白的策略：OCTN亚家族三个成员的成功案例

塞萨尔·英迪维尔¹, 米歇尔·加卢奇奥, 玛丽亚弗朗西丝卡, 洛伦娜·波奇尼

附属公司

PMID： 22843325
预防性维修识别码： PMC3636443型
内政部： 2007年10月10日/12033-012-9586-8

审查

细菌过度表达与人类健康相关的膜转运蛋白的策略：OCTN亚家族三个成员的成功案例

塞萨尔·英迪维尔等。分子生物技术. 2013年6月.

.2013年6月；54(2):724-36.

doi:10.1007/s12033-012-9586-8。

作者

塞萨尔·英迪维尔¹, 米歇尔·加卢奇奥, 玛丽亚弗朗西丝卡, 洛伦娜·波奇尼

附属

¹意大利阿卡瓦卡塔·迪伦德卡拉布里亚大学细胞生物学系。个人@unical.it

PMID： 22843325
预防性维修识别码： PMC3636443型
内政部： 2007年10月10日/12033-012-9586-8

摘要

OCTN亚家族包括结构和功能相关的OCTN1、2和3。这些转运蛋白参与维持肉碱稳态，肉碱稳态对哺乳动物的脂肪酸β-氧化、VLDL组装、翻译后修饰和其他基本功能至关重要。事实上，这些转运体的缺陷会导致严重的疾病。OCTN1和OCTN2在许多人体组织中表达，而OCTN3基因仅在小鼠和大鼠中被鉴定。转运蛋白以不同的效率和机制介导肉碱和其他底物的转运。为了过度表达这三种蛋白质，已经对大肠杆菌菌株与质粒构建体的许多组合进行了筛选。只有Rosetta（DE3）或Rosettagami2（DE3。首先通过携带融合蛋白标签的pET-41a（+）或pGEX-4T1获得较高的蛋白量，这需要额外的纯化通道。只携带6His标签的载体适合单传代纯化，尽管它们会导致较低的初始表达水平，但被优先选择。然后优化几个关键参数，增加表达式。hOCTN1是用pH6EX3在RosettaGami2（DE3）pLysS中获得的。使用罗塞塔（DE3）中的pET-21a（+）获得hOCTN2和mOCTN3。特别是，hOCTN2仅在密码子偏置后表达，用AAA（R2K突变）替代第二个三联体CGG。hOCTN1和mOCTN3的最佳生长条件为28°C和6 h诱导，而hOCTN2R2K的最佳诱导时间为4 h。细胞裂解液不溶部分中收集的蛋白质经sarkosyl溶解后，通过Ni-相关色谱纯化。mOCTN3、hOCTN1或hOCTN2R2K细胞培养的最终产量为2.0、3.0或3.5 mg/l。数据表明，尽管存在密切的进化关系，但几个因素在这三种蛋白质的细菌表达中起着不同的关键作用，因此不能强调一般标准。然而，处理相关蛋白的策略最终成功地过度表达了所有三个亚家族成员。

PubMed免责声明

数字

图1
OCTN亚家族蛋白质的比对。使用Clustal W软件对人OCTN1、人OCTN2和小鼠OCTN3进行校准。标识表示为星号保守或高度保守的替换表示为点或冒号分别是。保守的Cys残基位于盒TM-PRED软件预测并手动调整三种蛋白质的跨膜片段，表示为*白色方框*中突出显示了相应的序列灰色

图2
OCTN蛋白表达细胞株和质粒的筛选。筛选实验的三维表示一hOCTN1、，b条hOCTN2，和**c（c）**mOCTN3，其中不同*大肠杆菌*用每个所示质粒获得的构建物转染菌株。除RG2（DE3）（RosettaGami2（DE2）的缩写）外，菌株均以商业名称表示。直方图表示在所有实验条件优化后，每个蛋白质[39、50、51]的最大表达百分比的表达水平

图3
OCTN亚家族的拓扑结构，具有12个跨膜α-螺旋和一个大的细胞外环。该模型是在TM-PRED预测软件的基础上创建的（输出格式：最小17，最大29），并根据跨膜蛋白的既定标准进行了修改。跨膜节段编号为（1-12）。三个构件中相同的残留物（另见图1）分别用*一封信*氨基酸编码；所有蛋白质中不保守的残基表示为*X（X）*

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