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.2012年8月24日；287(35):29861-72.
doi:10.1074/jbc。M112.391961。 Epub 2012年7月13日。

失配修复酶在Friedreich共济失调诱导多能干细胞GAA·TTC三重重复序列扩增中的作用

杜金堂 1, 埃里卡·坎波, 伊丽莎白·索拉尼, 谢尔曼·库, 詹姆斯·W·帕克特, 彼得·德尔文, 乔尔·戈特斯菲尔德
附属公司

失配修复酶在Friedreich共济失调诱导多能干细胞GAA·TTC三重重复序列扩增中的作用

杜金堂等。 生物化学杂志. .

摘要

Friedreich共济失调（FRDA）的遗传突变是FXN基因第一内含子内三重重复序列GAA·TTC的过度扩增。尽管已有酵母和报告者构建的GAA·TTC三重重复序列扩增模型的报道，但由于可获得适当的细胞模型来研究人类基因组中GAA·TTC三重序列不稳定的机制，限制了对FRDA发病机制和治疗进展的研究。在此，用四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc转导后，从FRDA患者成纤维细胞生成诱导多能干细胞（iPSCs）。这些细胞在体外分化为神经球和神经元前体，为FRDA提供了有价值的细胞模型。在iPSCs的增殖过程中，GAA·TTC三重重复序列以大约两个GAA·TTC三重/复制的速率扩增。然而，GAA·TTC三重重复序列在FRDA成纤维细胞和神经干细胞中是稳定的。错配修复酶MSH2、MSH3和MSH6与其他三重重复性疾病的重复不稳定性有关，与成纤维细胞和神经干细胞相比，在多能干细胞中高表达，并占据FXN内含子1。此外，MSH2和MSH6的shRNA沉默阻碍了GAA·TTC三重重复序列的扩增。靶向GAA·TTC三重重复DNA的特异性吡咯-咪唑聚酰胺通过取代FRDA iPSC中FXN内含子1中的MSH2部分阻断重复扩增。这些研究表明，在FRDA中，GAA·TTC三重重复不稳定性发生在胚胎细胞中，涉及高度活跃的错配修复系统。

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数字

图1。
图1。
FRDA成纤维细胞和iPSCs GAA·TTC三重重复序列的常规PCR和SP-PCR。 A类，常规PCR扩增（～6600个基因组等效分子/反应）显示FRDA成纤维细胞和iPSC的GAA·TTC三重重复序列（第22代）。否定，负值。B类和C使用75和25个等效基因组对FRDA成纤维细胞和iPSCs（第22代）的GAA·TTC三重重复序列进行SP-PCR分析(例如。)分子/反应B类和C分别是。3816-纤维和3816-IPSC（第22代）是使用250个基因组等效分子/反应的SP-PCR的对照。这个虚线位于成纤维细胞和iPSC的PCR带之间。
图2。
图2。
随着时间的推移，GAA·TTC三重重复扩展。 A类，凝胶分析（来自左边到正确的)来自FRDA成纤维细胞（GM03816）和FRDA iPSCs（克隆8）不同传代DNA的PCR产物(对).B类，使用ImageJ软件分析GAA·TTC三重重复长度。显示每个等位基因的重复编号。C，GAA·TTC三重重复膨胀率（过流）。
图3。
图3。
GAA·TTC三重重复序列扩增在FRDA iPSCs中发生，但在成纤维细胞或神经球中不发生。 A类多能性mRNA标记的定量RT-PCR分析(10月4日,纳克、和泰特)和神经干细胞(地图2和巢穴).B类对FRDA成纤维细胞（GM03816）不同传代基因组DNA的PCR产物进行凝胶分析。CFRDA iPSCs和FRDA神经圈基因组DNA PCR产物的凝胶分析(NS公司)在不同的通道(对)或周(W公司).第11页*意味着用noggin诱导iPSCs。D类随着时间的推移，FRDA神经球中GAA·TTC三重重复序列是稳定的。凝胶分析（来自左边到正确的)在不同的收集时间（第2、4、6、8和10周），从FRDA成纤维细胞（GM03816）和FRDA神经球获得的DNA的PCR产物。否定，负值。E类，GAA·TTC三重重复扩展。所示为不同传代FRDA成纤维细胞（GM03816）和FRDA iPSCs（克隆16-1和16-2）DNA PCR产物的凝胶分析结果。
图4。
图4。
成纤维细胞、iPSCs、神经球和H1人类ESCs中MMR蛋白的表达。 A类、GM03816成纤维细胞、iPSCs和神经球中MSH2、MSH3和MSH6的Western blot结果。B类，中标准化为肌动蛋白的MSH2、MSH3和MSH6蛋白的密度分析交流未受影响的成纤维细胞（GM08333）、未受影响iPSCs（GM0833）和H1人类ESCs中MSH2、MSH3和MSH6的Western blot结果。D类、MSH2、MSH3和MSH6蛋白归一化为肌动蛋白的密度分析C肌动蛋白水平用作负荷控制。
图5。
图5。
GAA·TTC三重重复序列扩增涉及MMR酶MSH2和MSH6。 A类,面板1、FRDA iPSCs中MSH2、MSH3和MSH6蛋白的Western blot结果MSH2型-靶向shRNA(shMSH2型).面板2、MSH2、MSH3和MSH6蛋白归一化为肌动蛋白的密度分析面板1。面板3沉默前成纤维细胞、iPSCs中GAA·TTC三重重复序列的PCR(第20页)在四个通道(第24页)，六个通道(第26页)和八个通道(第28页)用打乱和MSH2型shRNA。面板4，加扰和MSH2型shRNA。在此，我们分析了较短扩增等位基因中GAA·TTC三重重复扩增的比率。B类,面板1FRDA iPSC中MSH2、MSH3和MSH6蛋白的Western blot结果MSH6号机组-靶向shRNAs。面板2、MSH2、MSH3和MSH6蛋白归一化为肌动蛋白的密度分析面板1。面板3，沉默前成纤维细胞中GAA·TTC三重态重复长度的PCR（起始iPSC；第16页)在四个通道(第20页)，六个通道(第22页)，和八个通道(第24页)用打乱和MSH6号机组shRNA。面板4，具有扰码和MSH6 shRNAs的iPSC中的GAA·TTC三重重复扩增率（过传代）。在此，我们分析了较短扩增等位基因中GAA·TTC三重重复扩增的比率。
图6。
图6。
聚酰胺FA1靶向GAA·TTC三重态重复DNA，部分阻断FRDA iPSC中的重复扩增。 A类聚酰胺FA1序列和结合模型。B类聚酰胺HIV-1序列和结合模型。填满和开放的圆圈是咪唑(伊姆河)和吡咯(派伊)分别为环；钻石β-丙氨酸（β）；这个曲线是γ-氨基丁酸（γ）；和半圆用一个加号是二甲氨基丙胺(Dp公司).C和D类、GAA·TTC三重重复序列PCR和GAA·TTC三重循环扩增率（过代(对))分别在未经治疗、FA1治疗和HIV-1治疗的iPSC中。HIV-1聚酰胺靶向CTG·CAG三重重复DNA。E类，聚酰胺FA1靶向GAA·TTC三重重复DNA取代MSH2FXN公司FRDA iPSC中的内含子1。F类,MSH2型-靶向shRNA(shMSH2型)将MSH2从FXN公司FRDA iPSC中的内含子1。在FRDA iPSC中使用针对FXN公司转录起始位点上游1254bp基因（−1254)和上游(向上GAA)和下游(向下GAA)GAA·TTC三重重复扩展。免疫沉淀恢复与内含子2有关。
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