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.2012;7（6）：e39132。
doi:10.1371/journal.pone.0039132。 Epub 2012年6月18日。

IkappaB激酶家族在Toll样受体信号传导期间磷酸化Ser935和Ser910的帕金森氏病激酶LRRK2

尼古拉斯·扎姆科 1, 弗朗西斯科·伊内斯塔·瓦奎拉, 张佳珍, 谢成松, 蔡怀滨, 西蒙·阿瑟, 李坦, Hwanguen Choi公司, 纳撒内尔·格雷, 菲利普·科恩, 帕特里克·佩德里奥利, 克里斯托弗·克拉克, 达里奥·阿莱西
附属公司

IkappaB激酶家族在Toll样受体信号传导期间磷酸化Ser935和Ser910的帕金森氏病激酶LRRK2

尼古拉斯·扎姆科等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）的突变与晚发型常染色体显性帕金森病密切相关。LRRK2在免疫细胞中高度表达，最近的研究表明LRRK2与先天免疫之间存在联系。在这里，我们证明MyD88依赖性激动剂刺激骨髓源性巨噬细胞（BMDM）或RAW264.7巨噬细胞中的Toll样受体（TLR）通路可诱导Ser910和Ser935处LRRK2的显著磷酸化，这些磷酸化位点调节14-3-3与LRRK2.的结合。这些残基的磷酸化通过敲除BMDM中的MyD88而不是替代TLR衔接蛋白TRIF来阻止。利用两种药物抑制剂，包括一种新的TAK1抑制剂NG25和遗传模型，我们提供了证据表明，经典的（IKKα和IKKβ）和IKK-相关的（IKε和TBK1）激酶介导TLR激动剂诱导的体内LRRK2磷酸化。此外，所有四个IKK成员在体外直接磷酸化Ser910和Ser935的LRRK2。与之前将Ser910和Ser935描述为LRRK2活性的药效学生物标记物的工作一致，我们发现在用LRRK_2激酶抑制剂治疗巨噬细胞后，Ser910与Ser935处LRRK2-的TLR非依赖性基础磷酸化被消除。然而，由MyD88途径的激活诱导的Ser910和Ser935的磷酸化增加对LRRK2激酶抑制剂不敏感。最后，利用LRRK2缺陷的BMDM，我们提供的数据表明，LRRK1在调节MyD88通路激活所诱导的炎性细胞因子的分泌方面没有发挥主要作用。我们的发现提供了LRRK2和调节许多免疫反应的IKK之间的第一个直接联系。需要进一步的工作来揭示IKK对LRRK2的磷酸化在控制巨噬细胞生物学中的生理作用，并确定IKK的LRRK_2磷酸化如何影响Ser910和Ser935作为药效学生物标记物的使用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：我们的研究单位从支持信号转导治疗部的制药公司（阿斯利康、勃林格殷格海姆、葛兰素史克、杨森制药、默克KgaA和辉瑞）获得一般资金支持。我还可以确认，这不会改变我们对所有PLoS ONE数据和材料共享政策的遵守。

数字

图1
图1。兔单克隆LRRK2抗体的制备。
(A类)针对人LRRK2残基100–500纯化的兔单克隆抗体用于免疫印迹5µg HEK293细胞裂解液，该细胞裂解液包含过表达的GFP-LRRK1变体、30µg LRRK3野生型和敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）裂解液和30µc人淋巴母细胞裂解液。将淋巴母细胞和MEF细胞加或减1µM LRRK2-IN1处理2 h。MEF LRRK2信号需要更长的暴露时间。(B)如中所示A类除了使用Ser935磷酸化的LRRK2兔单克隆抗体。
图2
图2。TLR激动剂增加Ser935的LRRK2磷酸化。
(A和B).在细胞裂解和用指定抗体进行免疫印迹之前，在指定的时间点用100 ng/ml LPS处理原始骨髓来源的巨噬细胞。(C&D公司)用1µg/ml Pam处理原始骨髓来源的巨噬细胞三CSK公司4在细胞裂解和用指定抗体进行免疫印迹之前的指定时间点。(E类)原代骨髓来源的巨噬细胞用以下TLR激动剂处理1小时。1µg/ml Pam三CSK公司4, 108细胞HKLM、10μg/ml LMW和HMW-Poly（I:C）、100 ng/ml LPS、10μg/ml Flagellin、1μg/ml FSL1、1μM CLO97和2.5μM ODN1826。(F&G公司)用10µg/ml Poly（I:C）处理原代骨髓来源的巨噬细胞，处理时间为所示时间点，然后用所示抗体进行细胞裂解和免疫印迹。所有免疫印迹至少代表两个独立的实验。
图3
图3。非TLR免疫激动剂不能增加LRRK2磷酸化。
(A类)在细胞裂解和用指定抗体进行免疫印迹之前，用100ng/ml TNFα处理原代骨髓来源的巨噬细胞指定的时间点。(B和C)如中所示A类除使用200µg/ml酵母聚糖外。(D和E)如中所示A类除了使用100µg/ml的可德兰。免疫印迹是至少两个独立实验的代表。
图4
图4。TLR诱导的LRRK2 Ser935磷酸化依赖于MYD88。
(A类)初级骨髓源性巨噬细胞由MYD88基因敲除小鼠和野生型同胞对照产生。用1µg/ml Pam刺激巨噬细胞三CSK公司4制备细胞裂解物并用所示抗体进行免疫印迹。(B)如中所示A类除了巨噬细胞是由TRIF基因敲除小鼠和野生型同胞对照产生的。所有免疫印迹至少代表两个独立的实验。
图5
图5。TLR信号传导期间的Ser935磷酸化不需要LRRK2激酶活性。
(A类)用指定浓度的LRRK2-IN1或CZC25146或DMSO处理原始骨髓源性巨噬细胞1小时，作为对照。制备细胞裂解物，并用指定抗体进行免疫印迹。(B)在用100 ng/ml LPS刺激1小时之前，用指示浓度的LRRK2-IN1或CZC25146或DMSO作为对照，预处理初级骨髓源性巨噬细胞1小时。制备细胞裂解物并用所示抗体进行免疫印迹。(C类)如中所示B除1µg/ml Pam外三CSK公司4被使用。(D类)用100 ng/ml LPS或1µg/ml Pam处理RAW264.7细胞三CSK公司4细胞溶解前1小时。用3µg兔单克隆LRRK2 100–500抗体从3 mg RAW264.7细胞裂解液中免疫沉淀内源性LRRK2。使用20µM Nictide测量激酶活性，n=4，一式两份。据报道，激酶活性为每分钟每毫克免疫沉淀的赖氨酸盐结合到肽中的ATP的pmol。使用平行的免疫沉淀集，通过重叠分析测量14-3-3结合。所有结果都代表了至少两个独立的实验。
图6
图6。TBK1和IKKε在TLR激活后调节LRRK2 Ser935磷酸化。A类
)SILAC实验示意图。B-E公司)包含Ser935的磷酸肽的提取离子电流(B)，序列号910(C类)和Ser955(D类)LRRK2和视神经素Ser177(E类). 未刺激的RAW264.7巨噬细胞的结果以蓝色显示，RAW2647巨噬细胞的结果用Pam刺激60分钟三CSK公司4（1µg/ml）为绿色，RAW264.7巨噬细胞在用Pam刺激前用2µM MRT67307预处理的结果三CSK公司4（1µg/ml）持续60分钟用红色表示(F类)表总结了在磷酸蛋白质组学筛选中鉴定的来自LRRK2的磷酸肽的结果。G公司)在用100 ng/ml LPS刺激指定时间点之前，用2µM MRT67307或DMSO对照预处理初级骨髓源性巨噬细胞1小时。免疫印迹是至少两个独立实验的代表。
图7
图7。IKKα和IKKβ有助于TLR激活后LRRK2 Ser935磷酸化。
(A类)在用100 ng/ml LPS刺激1 h之前，用DMSO、1µM 5z-7-氧代烷醇（TAK1抑制剂）、2µM NG25（TAK1抑制剂）、2µM MRT67307（TBK1/IKKε抑制剂）或10µM B1605906（IKKβ抑制剂）单独或以指定的组合处理初级骨髓源性巨噬细胞1 h。用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析。(B)骨髓源性巨噬细胞由激酶不活跃的IKKα双Ser176A和Ser180A敲除小鼠或同窝野生型对照产生。在用100 ng/ml LPS刺激1 h之前，用DMSO、2µM MRT67307（TBK1/IKKε抑制剂）或10µM B1605906（IKKβ抑制剂）处理巨噬细胞1 h。用所示抗体对细胞裂解液进行免疫印迹分析。(C类)如中所示A类除了用DMSO、1µM 5z-7-环氧乙烷醇（TAK1抑制剂）、2µM MRT67307（TBK1/IKKε抑制剂）单独或联合处理BMDM外，在用1µg/ml Pam刺激之前，BMDM处理1 h三CSK4或200µg/ml酵母多糖。(D类)Ha标记的IKKαIKKβIKKε和TBK1的野生型和激酶非活性变体通过转染HEK293细胞表达，然后通过Ha-agarose免疫沉淀。激酶用于在30°C下磷酸化细菌表达底物GST-LRRK2（882-1300）、GST-IκBα（2-54）和GST-IRF3（1-427）30分钟，然后用样品缓冲液终止反应。10%的体外磷酸化反应用于所示抗体的免疫印迹分析。E类)用表达TAK1和IKKε的杆状病毒在30℃下磷酸化细菌表达底物GST-LRRK2（882-1300）、GST-MKK6（2-334）和GST-IRF3（1-427）30 min，然后用样品缓冲液终止反应。10%的体外磷酸化反应用于指示抗体的免疫印迹分析或放射自显影。
图8
图8。LRRK2敲除巨噬细胞的急性IKK信号未受损。
骨髓源性巨噬细胞由LRRK2基因敲除小鼠和同窝对照鼠制备。在指定的时间点用100ng/ml LPS处理BMDM。细胞裂解物用所示抗体进行免疫印迹。结果代表了两个重复进行的独立实验。
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