Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases

doi:10.1002/hep.25873

.2012年11月；56(5):1946-57.

doi:10.1002/hep.25873。 Epub 2012年7月26日。

外泌体中的循环microRNA表明酒精性、药物性和炎症性肝病中的肝细胞损伤和炎症

沙市巴拉¹, 扬·彼得拉塞克, 希夫·蒙德库尔, 唐娜·卡塔拉诺, 伊凡·莱文, 珍妮·沃德, 哈瓦·阿劳, 凯伦·柯迪斯, Gyongyi Szabo公司

附属公司

PMID： 22684891
预防性维修识别码：项目经理3486954
内政部： 10.1002/hep.25873

外泌体中的循环microRNA表明酒精性、药物性和炎症性肝病中的肝细胞损伤和炎症

沙市巴拉等。肝病学. 2012年11月.

.2012年11月；56(5):1946-57.

doi:10.1002/hep.25873。 Epub 2012年7月26日。

作者

沙市巴拉¹, 扬·彼得拉塞克, 希夫·蒙德库尔, 唐娜·卡塔拉诺, 伊凡·莱文, 珍妮·沃德, 哈瓦·阿劳, 凯伦·柯迪斯, Gyongyi Szabo公司

附属

¹美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学医学院医学系。

PMID： 22684891
预防性维修识别码：项目经理3486954
内政部： 10.1002/hep.25873

摘要

微RNA是多种生物反应的微调器，在肝脏的各种细胞类型中表达。在此，我们假设循环microRNAs（miRNAs）可能是肝脏损伤和炎症的生物标志物。我们研究了肝细胞中丰富的miRNA-122和miR-155、-146a和-125b，它们调节酒精性肝病（ALD）、药物（扑热息痛，APAP）诱导的肝损伤（DILI）和Toll-like受体（TLR）9+4配体诱导的炎性细胞介导的肝损伤小鼠模型中免疫细胞的炎症。我们发现，在酒精、APAP和TLR9（CpG）+4（LPS）配体引起的肝损伤中，血清/血浆miR-122与丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高相关。在酒精性和炎症性肝损伤中，炎症调节因子MiR-155在血清/血浆中升高。酒精不能增加TLR4缺乏和p47phox缺乏小鼠的血清miR-122，这些小鼠受到ALD的保护。我们发现DILI中血浆miR-122的增加最为强劲，并与最高的ALT水平相关。与肝脏大量炎性细胞浸润一致，CpG+LPS给药后血浆miR-155和miR-146a显著升高。我们首次表明，取决于肝损伤的类型，循环miRNAs与富含外泌体或富含蛋白质的腔室相关。在ALD和炎症性肝损伤中，血清/血浆miR-122和miR-155主要与外泌体富集分数相关，而在DILI/APAP损伤中，这些miRNAs存在于蛋白富集分数中。

结论：我们的结果表明，循环miRNAs可作为区分肝细胞损伤和炎症的生物标志物，miRNAss的胞外体与蛋白质的相关性可为肝脏病理机制提供进一步的特异性。

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数字

**图1。酒精性肝病中循环miR-122和miR-155的增加**
8周龄C57BL/6雌性小鼠接受了5周的Liber De-Carli饮食，其中包括5%酒精（酒精喂养）或等热量饮食（双人喂养）。A.福尔马林固定的肝脏切片的苏木精和伊红（H&E）染色。实心箭头表示免疫细胞浸润，折断箭头表示肝细胞脂肪堆积，双箭头表示肝组织轻度坏死。按照方法（n=6–8）所述，测定血清中的ALT和miR-122水平（TaqMan qRT-real-time PCR）。C、血清ALT与血清miR-122的相关性采用Pearson法测定（n=30）。D.用ELISA法测定肝匀浆全细胞裂解液中TNFα的蛋白水平，并将其归一化为蛋白浓度（n=6–8）。TaqMan qRT-real-time PCR检测血清中E.MiR-155的表达（n=5）。使用合成秀丽线虫miR-39对Ct值进行归一化。与成对喂养的小鼠相比，计算了折叠变化。数据代表平均值±SEM。统计分析采用双尾t检验（B&D）或非参数Mann-Whitney检验（E）。

**图2。TLR4缺乏或氧化应激破坏可防止ALD患者血清miR-122增加**
野生型（WT）或TLR4-或p47^{凤凰（phox）}-缺陷小鼠（KO）喂食含Liber De-Carli的等热量（双份喂食）或酒精（乙醇喂食）5周。A.WT和TLR4KO小鼠福尔马林固定肝切片的H&E染色。B.WT和TLR4KO小鼠的血清ALT分析（n=6–7）。C.通过TaqMan qRT-real-time PCR（n=5-7）定量WT和TLR4KO小鼠血清中miR-122的表达。D.WT和p47肝切片的组织病理学（H&E）^{凤凰（phox）}KO小鼠。E.WT和p47的血清ALT分析^{凤凰（phox）}KO小鼠（n=6-7）。F.通过TaqMan qRT-real-time PCR检测WT和p47中血清中miR-122的表达^{凤凰（phox）}KO小鼠（n=6）。使用尖峰线虫miR-39使Ct值正常化。计算与配对喂养小鼠相比的折叠变化。数据代表平均值±SEM。统计分析采用双尾T检验（B、C和E）或非参数Mann-Whitney检验（F）。

**图3。APAP给药诱导血浆中miRNA的时间依赖性增加**
按照方法描述，野生型雌性小鼠（8周龄）隔夜禁食，第二天，一些小鼠接受生理盐水或APAP（500mg/kg，致死剂量）3h或6h。A.福尔马林固定肝切片的H&E染色。虚线箭头表示小叶中心细胞质液泡，实线箭头表示大的细胞质液泡，双箭头表示广泛的实质出血。B.血浆ALT水平（n=8）。C.通过TaqMan qRT-real time（n=8）定量血浆中miR-122的表达。D.血浆ALT和miR-122之间的相关性用Pearson法测定（n=23）。用TaqMan qRT-real-time PCR（n=8）测定血浆中miR-155（E）、-146a（F左）和miR-125b（F右）的相对表达。添加秀丽线虫miR-39作为内部对照。显示了盐水处理小鼠的折叠变化。数据表示平均值±SEM。采用非参数Mann-Whitney检验进行统计分析。

**图4。CpG+LPS诱导的肝脏炎症中血浆miRNA-122、-155和-146a的增加**
野生型雌性小鼠（10-12周龄）每天注射2.5mg/kg CpG DNA（i.p.）一次，连续三天，第4天，部分小鼠接受0.5mg/kg LPS或生理盐水，持续3h后处死。A.福尔马林固定肝切片的H&E染色。断箭头表示单核炎症细胞，实心箭头表示炎症灶B。血浆ALT水平（n=4-6）。C.通过TaqMan qRT-real time（n=4-6）定量血浆中miR-122的表达。D.血浆ALT和miR-122之间的相关性用Pearson法测定（n=17）。E.使用TNFα基因特异性引物通过实时PCR检测TNFα的表达，并将其归一化为18S。F.用TaqMan qRT-real-time PCR测定血浆中miR-155（左）和miR-146a（右）的相对表达，并用加标秀丽线虫miR-39作为内部对照（n=4-6）。显示了盐水处理小鼠的折叠变化。数据表示平均值±SEM。采用非参数Mann-Whitney检验进行统计分析。

**图5。循环miRNAs以肝脏损伤特异性的方式定位于富含外泌体或富含蛋白质的腔室**
按照方法所述，用ExoQuick Exosome沉淀溶液（SBI，System Biosciences）从血清或血浆中分离出富含外显体或蛋白质的组分，并用齐阿唑（Qiagen）进行裂解。用miRNeasy试剂盒（Qiagen）分离总RNA并用于miRNA检测。miR-122和miR-155的表达在从血清（左和右；ALD模型）和血浆（C左和右，APAP模型和E左和右、CpG模型）中分离的外显体或蛋白富集组分中进行定量。酒精（B）、APAP（D）和CpG+LPS（F）治疗后，定量肝脏中miR-122和miR-155的B&D&F表达（n=4-8）。添加秀丽线虫miR-39（血清或血浆）和SnoRNA202（肝脏）作为内部对照。显示了双喂（5A，B）或生理盐水（5C-F）处理小鼠的折叠变化。数据代表平均值±SEM。*与盐水处理小鼠相比，p<0.05。统计分析采用非参数Mann-Whitney检验。

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中的注释

非酒精性脂肪性肝病和心血管疾病中的循环MicroRNA-122信号：代谢综合征中的新内分泌系统。
Pirola CJ、Gianotti TF、Castaño GO、Sookoian S。 Pirola CJ等人。肝病学。2013年6月；57(6):2545-7. doi:10.1002/hep.26116。Epub 2013年3月6日。肝病学。2013 PMID：23111985 没有可用的摘要。
回复：PMID 22684891。
Szabo G，Bala S。 Szabo G等人。肝病学。2013年6月；57(6):2547. doi:10.1002/hep.26111。Epub 2013年5月28日。肝病学。2013 PMID：23112144 没有可用的摘要。

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