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.2012年6月29日；31（13）：2852-68。
doi:10.1038/emboj.2012.151。 Epub 2012年5月29日。

Pex3-anchored Atg36标记过氧化物酶体在酿酒酵母中降解

艾莉森·莫特利 1, 詹姆斯·纳托尔, 埃瓦尔德·H·赫特玛
附属公司

Pex3-anchored Atg36标记过氧化物酶体在酿酒酵母中降解

艾莉森·莫特利等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

当细胞代谢不再需要过氧化物酶体所包含的代谢途径时，过氧化物酶体会经历快速、选择性的自噬降解（pexophagy）。Pex3对过氧化物酶体的形成及其分离至关重要，因为它招募了这些功能的特定因子。在这里，我们描述了一种新的酿酒酵母蛋白，它在过氧化物酶体膜上与Pex3相互作用。我们将这种蛋白命名为Atg36，因为它的缺失会阻碍pexophagy，而它的过度表达会诱导pexopha。我们已经分离出pex3等位基因，这些等位基因在pexophagy中被特异阻断，不能将Atg36募集到过氧化物酶体中。如果Pex3被重定向到线粒体，Atg36就会被招募到线粒体，在那里它可以恢复缺乏线粒体吞噬受体Atg32的细胞的线粒体吞噬功能。此外，Atg36结合Atg8和连接选择性自噬受体和核心自噬机制的适配器Atg11。Atg36将过氧化物酶体输送到前自噬体结构，然后与过氧化物酶体一起内化到液泡中。我们得出的结论是，Pex3募集了巨噬细胞受体Atg36。这加强了Pex3在协调过氧化物酶体池大小方面发挥的关键作用，并确立了其在酿酒酵母pexophagy中的作用。

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数字

图1
图1
吞咽pexophagy需要Atg36。验证Pex11–GFP作为WT中pexophagy的标记物，atg1处Δ和第36页Δ单元格依据(一个)显微镜和(B类)western blot包括聚乙烯14Δ单元。荧光分析显示，与HcRed–PTS1、Pex11–GFP一样，GFP在饥饿培养基的液泡中积累(一个)对应于GFP在western blot上的积累(B类). (B类)细胞在油酸盐培养基中培养18小时，并切换到缺乏氮的葡萄糖培养基（SD-N），达到指定的时间。GFP*表示相对抗蛋白酶降解产物，表明液泡破裂。(C类)通过GFP–PTS1的荧光进行Pexophagy分析CTA1公司WT中的启动子，第36页Δ,atg1处Δ和pep4-3，prb1-1122菌株。按照上述方法培养细胞进行Pex11–GFP噬菌体测定，并在SD-N培养基中培养22小时后成像。在中获取了多个荧光图像Z轴-轴并展平为单个图像。亮场图像是一个平面。(D类)FM4-64中生长的细胞标签(C类). The three central images of aZ轴-烟囱被压平成一个平面。亮场图像是一个平面。棒材，5μm。(E类)通过在葡萄糖、油酸盐或甘油培养基中生长长达3天的细胞的Pex11–GFP蛋白质印迹检测的嗜酸细胞吞噬。WT电池样品（左侧面板）和第36页24、48和72小时后从培养物中取出Δ细胞（右侧）。
图2
图2
Cvt途径、有丝分裂或非特异性自噬不需要Atg36。(一个)通过野生型中Ape1–GFP的内源性表达来评估Cvt通路活性，第36页Δ和atg1处Δ单元。细胞在葡萄糖培养基中生长18 h，空泡用FM4-64染色。GFP在液泡中的积累表明通路功能正常。棒材，5μm。(B类)WT的二尖瓣，第36页Δ和atg1处在甘油培养基中培养3天后，通过OM45–GFP的western blot分析检测Δ细胞。每隔24小时取样一次。(C类)重量，第36页Δ和atg1处用碱性磷酸酶法检测Δ细胞的非特异性自噬。细胞在YPD中生长，并转移到SD-N培养基中4 h。收集并处理样品以检测Pho8Δ60活性。结果代表了三个实验的平均值和标准差。WT 4 h饥饿设置为100%。
图3
图3
Atg36定位于过氧化物酶体并诱导其自噬降解。(一个)N（左）和C（右）GFP标记自动液位计36在镀锌1启动子在第36页Δ或atg1处Δ单元。显示诱导后的早期（2小时）和晚期（5小时）时间点。利用过氧化物酶体标记物HcRed–PTS1（从组成成分中表达HIS3型发起人。(B类)Pex11–GFP western blot显示，在半乳糖培养基（0）中生长6 h的WT细胞发生了pexophage，然后切换到饥饿培养基中1、2或3 h，如图所示。（W） ，WT（空质粒）；（N） ，GAL1–mRFP–ATG36; (C类),GAL1–ATG36–mRFP; （U） ，GAL1–ATG36.WT通过内源性Atg36显示pexophagy。(C类)Pex11–含有空质粒（WT）或GAL1–mRFP–ATG36在油酸培养基（0）中生长18小时，然后切换到含有2%半乳糖的油酸培养基并在3、6或22小时收获。
图4
图4
Atg36通过Pex3结合过氧化物酶体。(一个)安在体外快速偶联转录/翻译分析使用大肠杆菌-产生GST–Pex3（40–441）和与谷胱甘肽Sepharose珠结合的GST。在广泛洗涤结合蛋白后，合成了Atg36在体外在以下人员在场的情况下[35S] -添加了蛋氨酸。进一步洗涤后，用GSH洗脱缓冲液洗脱蛋白质，并进行SDS-PAGE。结合组分和Atg36输入通过考马斯染色（底部面板）和磷成像（顶部面板）进行分析。使用纯珠样品作为进一步的对照*代表受约束的GST–Pex3（40–441），**代表受约束GST。(B类)第36页Δ聚乙烯3用编码质粒转化Δ细胞镀锌1–GFP–Atg36和a镀锌1–Tom70–Pex3–mRFP嵌合蛋白（左面板，顶部）或镀锌1–GFP–Atg36（右侧面板，顶部）。诱导表达3 h。用镀锌1–Tom70–Pex3–mRFP和preCox4–GFP（Motley等人，2008），以确认Tom70-Pex3-mRFP的线粒体定位。棒材，5μm。(C类)中的拆分-GFP分析atg8型Δ单元。表达GFP半体的细胞在半乳糖培养基中培养4小时，并对荧光的存在进行评分（−，无信号；+，荧光信号）。表达GFP–C-Atg36和Pex3–GFP-N的细胞中的过氧化物酶体通过与聚乙烯19Δ细胞表达HcRed–PTS1。在中获取了多个荧光图像Z轴-轴并展平为单个图像。亮场图像是一个平面。棒材，5μm。(D类)Pex3与Atg36的免疫共沉淀。使用表达Pex3-GFP或Pex13-GFP的质粒，在其内源性启动子的控制下，在C13深渊或C13–Atg36–PtA的背景菌株中进行IP。细胞在葡萄糖培养基中生长24小时至对数期后。使用IgG Sepharose珠从球形酵母裂解物中固定Atg36–PtA。用抗GFP和PAP检测SDS-PAGE凝胶。酵母裂解物占添加到小球中的裂解物的5%，并通过免疫印迹法进行分析。TL，总裂解物；IP，免疫沉淀。
图5
图5
这个聚乙烯3-177等位基因在pexophagy中受到影响。(一个)通过显微镜检测Pex11–GFP对聚乙烯3Δ电池和聚乙烯3Δatg1处用含有WT的质粒转化的Δ细胞PEX3系列或聚乙烯3-177或使用空质粒ycplac111。细胞在葡萄糖中生长，转移到油酸盐培养基中18 h，然后切换到SD-N培养基中22 h(B类)相同细胞在SD-N培养基上饥饿时的Western blot分析。GFP*表示相对抗蛋白酶降解产物，反映液泡破裂。显示了western blots的时间点。(C类)通过Pex13–GFP分解分析Pexophagy聚乙烯3Δ细胞携带上述质粒。(D类)Atg36定位分析聚乙烯3Δ细胞表达聚乙烯3,聚乙烯3-177和聚乙烯3-1.的母细胞聚乙烯3-1没有过氧化物酶体（黑色箭头）。(E类)Pex3-177与Atg36的免疫共沉淀。IP在C13–Atg36–PtA的背景菌株中进行，使用表达Pex3-177–GFP的质粒，在其内源性启动子的控制下进行。细胞在葡萄糖培养基中生长24小时至对数期后。使用IgG Sepharose珠固定来自球形酵母裂解物的Atg36–PtA。用抗GFP和PAP检测SDS-PAGE凝胶。酵母裂解物占添加到小球中的裂解物的5%，并通过免疫印迹法进行分析。TL，总裂解物；IP，免疫沉淀。与Pex3–GFP IP的比较（左侧面板）。
图6
图6
Atg36的表达和切割与Pex11–GFP降解相关。(一个)在质粒上表达基因组Atg36-PtA和Pex11-GFP的WT细胞在葡萄糖中培养22 h，转移到油酸盐培养基，然后转移到SD-N培养基。在指定的时间采集样品，并用过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物进行western blot检测，以检测Atg36–PtA（顶面板）或抗GFP，以检测Pex11–GFP噬菌体（底面板）。GFP*表示相对抗蛋白酶降解产物，反映液泡破裂。(B类)在油酸盐和饥饿条件下对所示菌株中指定时间点的基因组Atg36–GFP进行Western blot分析。(C类)WT基因组Atg36–GFP的Western blot分析，聚乙烯14Δ,atg1处Δ和聚乙烯3Δ细胞在油酸盐培养基中生长3天。每隔24小时取样一次。(D类)在葡萄糖培养基中培养22 h，将WT细胞转移到油酸盐培养基，然后转移到SD-N培养基中，测定总裂解液中的Pex3水平。在指定的时间采集样品，并用抗Pex3蛋白进行蛋白质印迹处理。一个聚乙烯3Δ葡萄糖22h样品用于测定抗体的特异性**表示非特定频带。(E类)蛋白质印迹分析聚乙烯3Δ和第36页Δ聚乙烯3Δ细胞在葡萄糖、油酸盐培养基中生长，并在指定的时间转移到SD-N培养基后，从其自身的启动子表达Pex3–GFP。
图7
图7
Atg11和Atg8绑定Atg36。(一个)Atg11和Atg8与Atg36的免疫共沉淀。在C13–Atg36–PtA中执行IPatg1处Δ或C13–Mvp1–PtAatg1处Δ细胞，其含有在控制下表达HA–Atg11或HA–Atg8的质粒第1阶段发起人。细胞在葡萄糖培养基中生长24 h至对数后阶段，然后在油酸盐培养基中再生长18 h。然后在非失活或饥饿条件下再生长2 h。使用IgG Sepharose珠固定来自球形酵母裂解物的Atg36–PtA或Mvp1–PtA。在大量洗涤后，结合物通过Tev蛋白酶裂解洗脱。用抗HA（单克隆12CA5）和PAP探测SDS-PAGE凝胶（显示百分比）。TL，总裂解物；IP，免疫沉淀（Tev洗脱液）。(B类–D类)GFP–Atg11在所示菌株中表达，细胞在葡萄糖培养基中生长至对数后阶段。插图显示了放大倍数和堆栈的各个切片atg1处Δ单元。棒材，5μm。
图8
图8
当Atg36直接作用于线粒体时，它会促进有丝分裂(一个)聚乙烯3Δ,聚乙烯3Δatg1处Δ和聚乙烯3Δ第32页Δ细胞在半乳糖培养基中培养6小时，以表达镀锌1–Tom70–Pex3–mRFP和GAL1–附件36–GFP。将细胞移到SD-N培养基中，12小时后成像Z轴-轴并展平为单个图像。亮场图像是一个平面。棒材，5μm。(B类)OM45在第32页Δ聚乙烯3Δ和第32页Δ聚乙烯3Δ第36页Δ细胞，用空质粒（−）或编码OM45–Pex3（+）的质粒转化。细胞在甘油培养基中培养3天，每隔24小时采集样本，进行抗GFP蛋白免疫印迹。GFP*表示相对抗蛋白酶降解产物，反映液泡破裂。
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中的注释

  • 有待努力争取；破坏过氧化物酶体。
    范德赞德A，雷焦里F。 van der Zand A等人。 EMBO J.2012年6月29日；31(13):2835-6. doi:10.1038/emboj.2012.152。Epub 2012年5月29日。 EMBO J.2012。 PMID：22643221 免费PMC文章。
  • 自噬：谁按下了自噬按钮？
    大卫·R。 大卫·R。 Nat Rev摩尔细胞生物学。2012年6月20日；13(7):406. doi:10.1038/nrm3384。 Nat Rev摩尔细胞生物学。2012 PMID：22713969 没有可用的摘要。

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参考文献

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