Liver fibrosis and hepatocyte apoptosis are attenuated by GKT137831, a novel NOX4/NOX1 inhibitor in vivo

doi:10.1016/j.freeradbiomed.2012.05.007

。2012年7月15日；53(2):289-96.

doi:10.1016/j.freeradbiomed.2012.05.007。 Epub 2012年5月19日。

新型NOX4/NOX1抑制剂GKT137831在体内减轻肝纤维化和肝细胞凋亡

乔伊·X·江¹, 陈香玲, Nobuko Serizawa公司, 塞德里克·西恩德拉莱维兹（Cédric Szyndralewiez）, 帕特里克·佩奇, 凯特琳·施罗德, 拉尔夫·布兰德斯, 斯里德维·德瓦拉吉, 娜塔莉·托洛克（Natalie Jörök）

附属公司

PMID： 22618020
预防性维修识别码：项目经理3392471
内政部： 2016年10月10日/j.freeradbiomed.2012.05.007

新型NOX4/NOX1抑制剂GKT137831在体内减轻肝纤维化和肝细胞凋亡

Joy X Jiang先生等。自由基生物医学。 2012。

。2012年7月15日；53(2):289-96.

doi:10.1016/j.freeradbiomed.2012.05.0007。 Epub 2012年5月19日。

作者

附属

¹美国加利福尼亚州萨克拉门托市加州大学戴维斯分校内科。

PMID： 22618020
预防性维修识别码：项目经理3392471
内政部： 2016年10月10日/j.freeradbiomed.2015.0007

摘要

活性氧（ROS）在慢性肝损伤和纤维化中起关键作用。NADPH氧化酶（NOX）同系物是活性氧的主要来源，但单个同系物在肝病中的确切作用尚不清楚。我们的目标是在药物抑制剂GKT137831的帮助下，确定NOX4在胆管结扎（BDL）诱导的肝纤维化中的作用，以及NOX4基因在小鼠中的缺失。GKT137831要么用于BDL的整个疗程（预防组），要么在术后10天开始（治疗组）。对含有和不含BDL的对照小鼠的原代肝星状细胞（HSC）进行分析，并研究NOX4抑制对HSC激活的影响。在野生型和NOX4（-/-）肝细胞中研究了FasL或TNFα/放线菌素D诱导的凋亡。在HSC中，NOX4通过TGF-β/Smad3依赖机制上调。NOX4的下调降低了ROS的生成，NOX4（-/-）HSC的激活减弱。NOX4（-/-）肝细胞对FasL或TNFα/放线菌素D诱导的凋亡更具抵抗力。同样，药物抑制NOX4后，ROS生成、纤维生成标记物表达和肝细胞凋亡均减少。NOX4在2-3期自身免疫性肝炎患者的肝脏中表达。NOX4基因缺失可减轻纤维化。预防组或治疗组灌胃GKT137831的BDL小鼠表现出较少的ROS生成，显著减轻纤维化，并减少肝细胞凋亡。总之，NOX4在肝纤维化中起关键作用。GKT137831是一种有效的纤维化和肝细胞凋亡抑制剂；因此，它是未来翻译研究的一种很有前景的治疗剂。

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利益冲突声明

利益冲突：无

数字

**图1。TGF-β/Smad 3介导机制诱导培养激活的肝星状细胞和胆管结扎小鼠分离的星状细胞中NOX4的表达**
实时PCR评估静止状态（第1天）和培养激活的HSC（第8天）中NOX4的表达。随着HSC激活，NOX4显著上调（图1A；平均值±SED，N=4，*p<0.05）。用Ad-DNSmad3或wt-Smad3感染HSC，暴露于TGF-β1，并通过实时PCR检测其表达。TGF-β1显著诱导了对照组和wt-Smad3感染的HSC的表达，而DN Smad3阻止了诱导（图1B；平均值±SED，N=3，*p<0.05，**p<0.01，NT=未转染）。在BDL期间不同时间点分离的HSC的Western blot分析显示，在转录物（图1C，表示为折叠对照，N=4，#p<0.05，*p<0.01）和蛋白质水平（图1D，N=3，平均值±SED）中，NOX4逐渐诱导。在自身免疫性肝炎患者中，NOX4（图1E，绿色，a）与表达αSMA（红色，b）的肌成纤维细胞共定位（重叠图像，c）。研究了2-3期纤维化患者的肝活检样本（N=6），来自3期疾病患者的代表性图像（Bar=30μm）。

**图2。NOX4在ROS生成和HSC激活中发挥作用**
用打乱的siRNA或NOX4 siRNA转染培养活化的HSC（转染后细胞活力没有显著变化，补充数据2A）。Lucigenin分析表明，与打乱siRNA处理的细胞（NT，非转染细胞）相比，NOX4 siRNA降低了ROS的生成。（图2A，平均值±SED，折叠控制，N=4*p<0.05）。初级、wt或NOX4^−/−HSC培养8天，检测促纤维化基因α1（I）、αSMA和NOX4的表达。培养激活诱导wt细胞中这些转录物显著上调（图2B，数据表示平均值±SED，折叠对照，N=4，*p<0.001），而NOX4中未发现诱导^−/−细胞。对wt和NOX4进行BDL^−/−qPCR检测小鼠α1（I）前胶原和αSMA的表达。NOX4中这两种转录物均显著下调^−/−肝脏（图2C，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001，N=5）。αSMA在NOX4中的免疫反应性降低^−/−肝脏（图2D，αSMA：红色，蓝色：DAPI）。

**图3。使用NOX4/NOX1抑制剂GKT137831减少ROS的生成和肝星状细胞的活化**
用GKT137831（20μM）处理的原代培养活化HSC显示出显著降低ROS生成（图3A，数据表示平均值±SED，折叠对照，N=4，**p=0.01）。经GKT137831治疗的HSC显示纤维前胶原α1（I）、αSMA和TGF-β的表达显著降低。（图3B，数据表示平均值±SED，折叠控制，N=5，*p=0.01，**p<0.01，***p<0.001）。

**图4。NOX4在FasL和TNF-α诱导肝细胞凋亡中的作用**
主要野生型（wt）或NOX4^−/−在GSH酯存在或不存在的情况下，用FasL或TNFα/ActD处理肝细胞以诱导凋亡。进行免疫荧光研究以检测活性caspase-3，并在3个实验中计算5个不同领域的阳性细胞百分比。谷胱甘肽酯降低了细胞凋亡率（**p<0.01）。NOX4肝细胞中^−/−与wt小鼠相比，FasL小鼠诱导的凋亡显著减少（图4A，caspase 3活性亚单位阳性细胞的百分比，N=3，*p<0.05）。正如预期的那样，TNFα/ActD诱导了wt肝细胞的显著凋亡，而这在NOX4中被减弱^−/−细胞（图4B，*p<0.05）。为了评估GKT137831对细胞凋亡的影响，用FasL处理有或没有GKT137.831预孵育的肝细胞。GKT137831显著降低FasL诱导的细胞凋亡（图4C，N=4，*p<0.05）。

**图5。NOX4/NOX1抑制剂GKT137831降低ROS生成、肝细胞凋亡和血清ALT水平体内**
BDL小鼠每天用60mg/kg GKT灌胃1.5周（手术后第10天开始）或3周。作为对照，使用溶剂（3周）。lucigenin分析显示，BDL在溶剂处理组中诱导了ROS的生成（比假手术小鼠增加了3.1倍），而GKT137831的3周处理将其减少到1.5倍。（平均值±SED，折叠对照，每组N=6只小鼠，p<0.05，图5A）。活性caspase-3亚单位（红色）的免疫荧光显示溶剂处理的BDL肝脏中的肝细胞凋亡。GKT137831处理的肝脏中凋亡细胞数量减少。蓝色：DAPI，核染色（图5B，所示为3w BDL组的溶剂处理数据）。检测血清中的ALT和胆红素值，BDL动物的ALT与胆红素均升高，但在GKT137831治疗3周后降低。与使用溶剂治疗的假手术小鼠相比，BDL GKT137831治疗小鼠的ALT没有显著增加（图5C，平均值±SED，每组6只小鼠，*p<0.05）。

**图6。灌胃GKT137831后BDL可减轻小鼠肝纤维化**
实时PCR数据表明，促纤维化基因胶原α1（I）、αSMA和TGFβ的表达被GKT137831显著抑制（图6A，3w BDL组的溶剂处理数据）。使用较高的抑制剂剂量方案并没有进一步改善纤维化标记物。苦味酸红染色（B）显示BDL溶剂组出现显著的肝纤维化，而GKT137831处理的小鼠则减少了纤维化。羟脯氨酸测定（C）显示，GKT137831治疗1.5周和3周后，肝脏中的胶原蛋白量均显著降低（平均值±SED，每组6只小鼠，*p<0.05，**p<0.01）。

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