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.2012年6月29日；46(6):833-46.
doi:10.1016/j.molcel.2012.04.007。 Epub 2012年5月9日。

SH3BP4是氨基酸-Rag GTPase-mTORC1信号的负调控因子

Young-Mi Kim（金永美） 1, 马特·斯通, 黄泰贤, 延吉·金, 简·R·邓利维, 蒂莫西·格里芬, Do-Hyung Kim先生
附属公司

SH3BP4是氨基酸-Rag GTPase-mTORC1信号的负调控因子

Young-Mi Kim（金永美）等。 分子电池. .

摘要

氨基酸通过激活mTORC1刺激细胞生长并抑制自噬。氨基酸对mTORC1的激活是由溶酶体上的鸟苷三磷酸酶（GTPase）异二聚体介导的。氨基酸调节Rag GTPase异二聚体的分子机制尚待阐明。在这里，我们确定SH3结构域结合蛋白4（SH3BP4）是Rag GTPase复合物的结合蛋白和负调节蛋白。在氨基酸饥饿条件下，SH3BP4通过其Src同源性3（SH3）结构域与非活性Rag GTPase复合物结合，并抑制活性Rag-GTPase复合物的形成。因此，这种结合消除了mTORC1与Rag GTPase复合物的相互作用以及mTORC2向溶酶体的募集，从而抑制氨基酸诱导的mTORCl活化和细胞生长，促进自噬。这些结果表明，SH3BP4是Rag GTPase复合物和氨基酸依赖性mTORC1信号的负调控因子。

PubMed免责声明

利益冲突声明

本研究不存在财务利益冲突。

数字

图1
图1。SH3BP4优先结合Rag GTPases的GDP结合状态
(A类)SH3BP4结构特征示意图。SH3BP4具有一个LIDL基序（一个假定的氯菊酯结合基序）、一个SH3结构域、三个NPF重复序列（假定的Eps15同源结构域结合位点）、一种WxxF基序（假定的AP2结合位点）和一个线圈（CC）区域。(B类)SH3BP4与Rag GTP酶相互作用。HA-标记的SH3BP4与myc标记的构建物在HEK293T细胞中共同表达。通过Western blotting（WB）分析与myc标记构建物共同免疫纯化的HA-SH3BP4的量。PA-PLA和S6K1是控制蛋白。(C类)SH3BP4直接与Rag GTPases结合。用WB分析谷胱甘肽树脂固定的GST（对照）或GST标记Rag GTPase结合的SH3BP4量。蛋白质是由细菌制备的(D类)SH3BP4优先与RagB结合国内生产总值和RagC国内生产总值在HEK293T细胞中用HA标记的SH3BP4表达标记的RagB和RagC WT或突变体。WB分析与标记Rag GTPases结合的HA-SH3BP4的数量。箭头指向IgG带。(E类)SH3BP4直接与RagB结合国内生产总值用WB分析与标记Rag GTPases结合的SH3BP4的数量。这些蛋白质是从细菌中纯化出来的(F类)SH3BP4优先与非活性Rag GTPase复合物结合。在HEK293T细胞中表达Myc-tagged Rag WT和突变体。WB分析与内源性SH3BP4共同免疫纯化的Rag GTPases的数量。Arl1用作对照。(G公司)SH3BP4与非活性Rag复合体结合，但与活性Rag复合物不结合。Rag GTPases和SH3BP4在HEK293T细胞中表达。WB分析与RagC共免疫纯化的SH3BP4和RagB的数量。(H（H）)SH3BP4与RagB同款国内生产总值但几乎没有WT或RagB全球技术伙伴通过荧光显微镜观察在HeLa细胞中瞬时表达的GFP-SH3BP4（绿色）和mCherry RagB（红色）。（插图）高倍放大显示SH3BP4和RagB的共定位国内生产总值（黄色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，10µm。右侧的线扫描显示SH3BP4和RagB之间的共定位程度，这与合并图像的插入框中绘制的线相关。
图2
图2。SH3BP4-Rag相互作用受氨基酸调节
(A类)与RagB结合的SH3BP4受氨基酸负调控。HeLa细胞缺乏亮氨酸40分钟，然后以104µg/ml（+）的浓度补充亮氨酸，或在无亮氨酸的情况下进一步培养10分钟（−）。如前所述，培养基中存在所有其他氨基酸（Kim等人，2002年）。使用抗SH3BP4抗体分离内源性SH3BP4。WB分析SH3BP4回收内源性RagB的量。(B类)SH3BP4绑定到RagB国内生产总值受氨基酸负调控。Myc-tagged RagB WT，RagB全球技术伙伴或RagB国内生产总值在HEK293T细胞中用HA-SH3BP4表达。如图2A所示，用亮氨酸处理细胞。WB分析myc-RagB回收的HA-SH3BP4量。(C类)SH3BP4绑定到RagB国内生产总值-RagC公司国内生产总值随着培养基中亮氨酸水平的增加，复合物逐渐减少。表达myc标记RagB的HEK293T细胞国内生产总值和RagC国内生产总值如图2A所示，用亮氨酸（0、1.04、10.4或104µg/ml）处理。用WB分析与内源性SH3BP4共同免疫纯化的Rag GTPases的数量。(D类)亮氨酸剥夺诱导SH3BP4与RagB共定位。GFP标记的SH3BP4在HeLa细胞中与mCherry-RagB共表达。如图2A所示，用亮氨酸处理细胞。荧光显微镜分析SH3BP4与RagB的共定位。比例尺，10µm。
图3
图3。SH3BP4负调控mTORC1信号传导
(A类)SH3BP4敲除增强氨基酸依赖性mTORC1信号传导。如图2A所示，用亮氨酸处理SH3BP4 shRNA或打乱shRNA稳定转导的HEK293T、HeLa和MEF。WB监测细胞裂解液中p-S6K1（Thr389）和p-4E-BP1（Ser65）的水平。(B类)如图2A所示，用0、1.04、5.2、10.4、52或104µg/ml的亮氨酸处理由shRNAs稳定转导的HEK293T细胞。WB分析p-S6K1水平。(C类)SH3BP4的过度表达抑制了mTORC1信号传导。如图2A所示，用亮氨酸（HEK293T为0、1.04、10.4或104µg/ml，HeLa为104µ/ml）处理稳定表达myc-SH3BP4的HEK293 T和HeLa细胞。用WB分析细胞裂解液中p-S6K1（Thr389）和p-4E-BP1（Ser65）的水平。(D类)SH3BP4对mTORC1信号的负作用与TSC2无关。Myc-SH3BP4和HA-S6K1在TSC2-silenced或打乱siRNA转导的HEK293T细胞中表达。如图2A所示，用亮氨酸处理细胞。WB分析HA免疫沉淀中p-S6K1的水平。(E类)SH3BP4-Rag相互作用由亮氨酸调节，但在培养基中既不受胰岛素也不受葡萄糖调节。表达myc-RagB的HEK293T细胞国内生产总值将HA-SH3BP4饥饿40分钟以获取亮氨酸或葡萄糖，并补充亮氨酸（104µg/ml）或葡萄糖（11 mM）10分钟。将胰岛素（150 nM）处理至细胞，并在隔夜血清饥饿后培养1小时。用myc-RagB回收的HASH3BP4量国内生产总值WB分析。(F类)TfR敲除并不抑制HEK293T细胞中的mTORC1信号。如图2A所示，用亮氨酸处理TfR沉默的细胞。WB监测p-S6K1水平。(G公司)动力蛋白1和动力蛋白2的缺乏并不影响MEF细胞中S6K1的磷酸化。如图2A所示，用亮氨酸处理缺乏动力蛋白1和2的MEF。WB监测p-S6K1水平。
图4
图4。SH3BP4负调节细胞生长并促进自噬
(A、 B类)SH3BP4敲除增加HEK293T（A）和HeLa细胞（B）的增殖率。结果表示为平均值±标准偏差（SD）（n=3）。(C类)SH3BP4基因敲除增加了HEK293T细胞的平均大小。对照细胞和SH3BP4细胞的平均±SD细胞直径（µm）分别为16.7±0.08和17.1±0.01。(D类)HEK293T细胞中SH3BP4的稳定过度表达显著降低了细胞增殖率。误差条表示平均值±SD（n=6）。(E类)SH3BP4促进自噬。稳定表达SH3BP4的HEK293T细胞缺乏亮氨酸30分钟（−），然后补充亮氨酸（104µg/ml）（+）2小时。通过WB分析LC3-I、LC3-II和p62的水平。(F类)SH3BP4过度表达诱导LC3点的形成。GFP标记的LC3在HeLa细胞中用HA-SH3BP4表达。使用空载体（mock）作为SH3BP4的对照。在荧光显微镜下观察到GFP-LC3点。比例尺，10µm。(G公司)每个细胞GFP-LC3点的定量分析（*，第页<0.001来自学生t吨-试验，n=23）。平均值显示为水平条。
图5
图5。SH3BP4在Rag GTPases上游起作用，对mTORC1起负调节作用
(A类)Myc-tagged RagB和RagC构建物在打乱shRNA-转导或SH3BP4-silenced HEK293T细胞中用HA-S6K1表达。如图2A所示，用亮氨酸处理细胞。WB分析HA免疫沉淀中p-S6K1（Thr389）的水平。(B类)Myc标记的RagB和RagC构建体用Myc-SH3BP4和HA-S6K1在HEK293T细胞中表达。如图2A所示，用亮氨酸处理细胞。WB分析HA免疫沉淀中p-S6K1的水平。(C类)SH3BP4负调节溶酶体mTOR定位。GFP标记的SH3BP4或GFP单独（模拟）在HeLa细胞中瞬时表达。转染两天后，用亮氨酸处理细胞，如图2A所示。使用mTOR（绿色）和LAMP1（红色）特异性抗体对细胞进行染色，并通过荧光显微镜进行观察。（插图）高倍放大显示mTOR和LAMP1的共定位（黄色）。比例尺，10µm。(D类)SH3BP4抑制Rag GTPases和猛禽之间的相互作用。在HEK293T细胞中，HA标记的猛禽和SH3BP4与myc标记的RagB和RagC共表达。WB分析用myc-Rag GTPases共免疫纯化的HA-受体数量。
图6
图6。SH3BP4通过其SH3结构域与Rag GTPases结合对抑制mTORC1信号传导很重要
(A、 B类)SH3BP4的N末端片段以二聚体形式（A）或单体形式（B）与RagB和RagC结合。SH3BP4的Myc标记片段在HEK293T细胞中分别用（A）HA标记的RagB和RagC或（B）RagB或RagC表达。转染后48小时，细胞在不含亮氨酸的培养基中培养40分钟。用WB分析与SH3BP4片段结合的HA标记的RagB和RagC数量。(C类)SH3BP4W92A突变抑制SH3BP4与RagB和RagC的结合。用myc标记的RagB表达HA标记的SH3BP4 WT或W92A突变体国内生产总值或RagC国内生产总值在HEK293T细胞中。myc-RagB回收的HA-SH3BP4量国内生产总值或myc RagC国内生产总值由WB进行评估。(D类)SH3BP4 W92A突变破坏了SH3BP4-Rag GTPase相互作用的亮氨酸依赖性调节。表达SH3BP4和RagB的HEK293T细胞国内生产总值如（C）中所述，用图2A中所述的亮氨酸处理。与myc-RagB结合的HA-SH3BP4量国内生产总值进行了分析。(E类)稳定或(F类)SH3BP4 W92A突变体的瞬时过表达消除了SH3PP4对mTORC1的抑制作用。如图2A所示，用亮氨酸处理HEK293T细胞，WB分析内源性S6K1和4EBP1（E）或myc标记的S6K1（F）的磷酸化状态。(G公司)W92A突变减弱了SH3BP4对细胞增殖的抑制作用。通过模拟载体或SH3BP4构建物稳定转导的HEK293T细胞进行细胞增殖分析。结果表示为平均值±标准偏差（n=6）。(H（H）)W92A突变抑制SH3BP4对细胞生长的负面影响。模拟、WT和W92A细胞的平均±SD细胞直径分别为17.16±0.08、16.96±0.09和17.10±0.01µm。(我)W92A突变抑制SH3BP4对HeLa细胞LC3点形成的刺激作用。如图4F所示，对GFP-LC3斑点进行分析。比例尺，10µm。(J型)每个细胞GFP-LC3点的定量分析（*，第页< 0.05, **,第页<0.01，n=13）。平均值显示为水平条。
图7
图7。SH3BP4抑制活性Rag GTPase复合物的形成
(A类)SH3BP4-Rag相互作用抑制mTOR定位到溶酶体。GFP标记的SH3BP4 WT或W92A在HeLa细胞中瞬时表达。对照细胞通过GFP空载体（−）转导。如图5C所示，分析内源性mTOR（绿色）和LAMP1（红色）的共定位。(B类)SH3BP4-Rag相互作用对于抑制raptor-Rag相互作用非常重要。用SH3BP4 WT或W92A在HEK293T细胞中表达HA标记的猛禽和鞭毛标记的Rag GTPases。对照细胞通过空载体（−）而非SH3BP4结构体转导。用WB分析Rag GTPases免疫纯化的HA-受体数量。(C类)根据（B）中的数据定量猛禽与RagB的结合。数值为平均值±SD（n=2）。(D类)SH3BP4抑制GDP与Rag GTPases的分离，后者被W92A突变所抑制。y轴表示三H-Rag GTP释放的GDP相对于三在添加GTPγS之前，H-GDP与Rag GTP酶结合。使用的蛋白质是从细菌中制备的。该图是三个独立实验的代表。(E类)SH3BP4抑制Rag GTP酶的GTP水解活性，该活性被W92A突变抑制。金额32分析Rag GTPases释放的P随时间的变化，并在y轴上表示为相对于单独培养Rag GTPases 30分钟时测得的GTP水解的百分比。该图是三个独立实验的代表。图中使用了与（D）中相同的符号。(F类)在与不同浓度的SH3BP4孵育30 min时，分析了SH3BP4RagB-RagC复合物对GTP水解的抑制作用。误差条表示平均值±SD（n=4）。(G公司)SH3BP4抑制氨基酸诱导的GTP加载到RagB上。在HEK293T细胞中用myc-RagB表达HA-SH3BP4 WT或W92A。对照细胞通过模拟载体（−）而非SH3BP4结构体转导。细胞与[32P] 在补充实验程序中描述的氨基酸存在或不存在的情况下。结合在免疫纯化myc-RagB上的核苷酸通过薄层色谱和放射自显影术进行分析。底部的数字表示绑定到RagB的GTP的百分比。(H（H）)SH3BP4对Rag GTPase-MMORC1信号传导的抑制功能模型。
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