Genomic targets of Brachyury (T) in differentiating mouse embryonic stem cells

doi:10.1371/journal.pone.0033346

.2012;7（3）：e33346。

doi:10.1371/journal.pone.0033346。 Epub 2012年3月30日。

Brachyury（T）在小鼠胚胎干细胞分化中的基因组靶点

阿曼达·L·埃文斯¹, 蒂亚戈·法亚尔, 迈克尔·吉尔克里斯特, 托马斯·唐恩, 卢多维克·瓦利埃, 罗杰·佩德森, 菲奥娜·C·沃德, 詹姆斯·C·史密斯

附属公司

PMID： 22479388
预防性维修识别码： PMC3316570型
内政部： 10.1371/日记.pone.0033346

Brachyury（T）在小鼠胚胎干细胞分化中的基因组靶点

阿曼达·L·埃文斯等。公共科学图书馆一号. 2012.

.2012;7（3）：e33346。

doi:10.1371/journal.pone.0033346。 Epub 2012年3月30日。

作者

阿曼达·L·埃文斯¹, 蒂亚戈·法亚尔, 迈克尔·吉尔克里斯特, 托马斯·唐恩, 卢多维克·瓦利埃, 罗杰·佩德森, 菲奥娜·C·沃德, 詹姆斯·C·史密斯

附属

¹英国剑桥大学威康信托/英国古顿癌症研究所。

PMID： 22479388
预防性维修识别码： PMC3316570型
内政部： 10.1371/日记.pone.0033346

摘要

背景：T-box转录因子Brachyury（T）对脊椎动物胚胎中后中胚层和脊索的形成至关重要。对青蛙和斑马鱼的研究已经确定了Brachyury的一些直接基因组靶点，但对小鼠的Brachyry靶点知之甚少。

方法/主要发现：在这里，我们使用染色质免疫沉淀和小鼠启动子微阵列来识别由分化小鼠ES细胞形成的胚胎体中Brachyury的靶点。我们确定的靶点富含序列特异性DNA结合蛋白，并包括信号转导途径的组成部分，这些信号转导通路在早期胚胎的原始条纹和尾芽中指导细胞命运。其中一些靶点的表达，如Axin2、Fgf8和Wnt3a，在Brachyury突变胚胎中下调，我们证明它们也是人类的Brachyuri靶点。令人惊讶的是，在大多数Brachyury靶基因附近，我们没有观察到典型T域DNA结合序列5'-TCACACCT-3'的富集。相反，我们确定了一个（AC）（n）重复序列，该序列在大鼠中保守，但在人类、斑马鱼或爪蟾中不保守。我们不了解该序列的意义，但推测它增强了啮齿动物Brachyury靶基因调控区中转录因子的结合。

结论/意义：我们的工作确定了早期小鼠胚胎中胚层形成关键调控因子的基因组靶点，从而提供了对Brachyury驱动的遗传调控网络的见解，并允许我们比较Brachyuri在不同物种中的功能。

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利益冲突声明

竞争利益：在完成工作期间，RAP实验室耗材资金的一部分由PluriSys提供。PluriSys是由欧洲委员会资助的非商业FP7财团赠款。匈牙利有限公司BioTalentum负责协调PluriSys财团，但不对财团产生的材料或结果产生任何商业利益。没有专利、正在开发的产品或已上市的产品需要申报。这并不会改变作者对所有PLoS ONE数据和材料共享政策的遵守程度。

数字

**图1。的时间表达模式*Brachyury公司*在早期ES细胞分化过程中。**
该图显示了胚状体纺纱机培养物的定量RT-PCR图谱。*Brachyury公司*表达式是相对于*β肌动蛋白*图像显示第0天小鼠胚胎成纤维细胞喂食器上的未分化R1细胞，第2天的早期幼胚集落，以及第3天、第4天（交联时）和第5天的类胚体。

**图2。Brachyury目标分析。**
（A）饼图显示了Brachyury靶基因在小鼠胚胎中开始表达的发育时间（占总数的百分比；n=396）。大多数基因（63%）在E7.5之间开始表达，当*Brachyury公司*在原始条纹、脊索和尾芽以及E17.5中表达，仅在树干间质中表达。在显示这种时间表达模式的靶标中，30%仅限于中胚层衍生物，如右侧条形图所示。其他则以外胚层、中胚层和内胚层的不同组合表达。（B）通过RT-PCR获得Brachyury转录因子靶在旋转培养ES细胞分化期间的时间表达。顶行中的三个面板取自一批电池，其中*Brachyury公司*表达在培养第4天达到高峰；其余的是从一批中取出的*Brachyury公司*表达在第3天达到高峰。所有显示了三次测量的平均值，并归一化为*β肌动蛋白*.福克斯2和*福克斯1*在顶行峰值*Brachyury公司*第4天；下面板中的基因峰值晚于*Brachyury公司*.

**图3。Wnt途径的组成部分是Brachyury的靶点。**
（A） Wnt信号通路。箭头表示积极互动，条形表示消极互动。本研究中确定的目标概述如下**大胆的**（B–E）周围基因组区域的Brachyury结合*Dkk1公司*（B）；*Ctnb1号机组*/*β-连环蛋白*（C）；*驱动器3*（D）；和*γ-连环蛋白*/*jup公司*/*斑球蛋白*（E） ●●●●。每个靶点都显示出相对于染色体位置的折叠富集。蓝色条表示T盒状站点TSACANNT（N=任何基础，S=G/C），绿色条表示（AC）_n个。横条上方的星形代表反向链上的序列。图是三份芯片结果的平均值，与2006年2月的mm8组装一致。

**图4。分析*Wnt3a型*Wnt通路的正调控因子。**
（A）位置分析*Wnt3a型*图（和图5、6）显示了相对于染色体位置的折叠富集。曲线图是三份芯片结果的平均值，与2006年2月的mm8组装一致。蓝色条表示T盒状站点TSACANNT（N=任何基础，S=G/C）；绿色条表示（AC）_n个; 红色表示TCACACCT的共识。横条上方的星星代表反向链上的序列。（B）定量RT-PCR表达谱*Wnt3a型*在ES细胞分化过程中，相对于*β肌动蛋白*.（C，D）的表达式*Wnt3a型*原位杂交研究；在每个图像中，顶部图像显示背面视图，底部图像显示侧面视图。（C）表型野生型（+/+或+/T型)E8.5–8.75的胚胎和（D）突变株(T型/T型)杂交后代的胚胎*Brachyury公司*杂合突变小鼠。*Wnt3a型*用NBT/BCIP（紫色）检测表达，在双重染色后，插图显示侧面*Brachyury公司*用INT/BCIP检测（橙棕色）。注意在野生型胚胎中*Wnt3a型*表达于尾芽和近轴中胚层。在突变胚胎中*Wnt3a型*染色缺失或大大减少（n=3）。比例尺显示250µm。

**图5。分析轴2，Wnt途径的负调节因子。**
（A）位置分析轴2有关详细信息，请参见图4的图例。（B）定量RT-PCR表达谱轴2在ES细胞分化过程中，相对于*β肌动蛋白*.（C，D）的表达式轴2原位杂交研究；在每个图像中，顶部图像显示背面视图，底部图像显示侧面视图。（C）表型野生型（+/+或+/T型)E8.5–8.75的胚胎和（D）突变体(T型/T型)胚胎，均来自*Brachyury公司*杂合突变小鼠。轴2用NBT/BCIP（紫色）检测表达，在双重染色后，插图显示侧面*Brachyury公司*用INT/BCIP检测（橙棕色）。注意在野生型胚胎中轴2表达于神经褶皱的尾芽、近轴中胚层和侧缘。在突变胚胎中轴2大大减少（n=9）。比例尺为250µm。

**图6。*Fgf8型*成为Brachyury的目标。**
（A）位置分析*Fgf8型*有关方法的详细信息，请参见图4的图例。（B）定量RT-PCR表达谱*Fgf8型*在ES细胞分化过程中，相对于*β肌动蛋白*.（C）表达*Fgf8型*通过原位杂交研究。图像显示表型野生型（+/+或+/T型)胚胎（顶对）和一个突变体T型/T型（下一对）胚胎来自*Brachyury公司*杂合突变小鼠。野生型胚胎方向为左前右后；从后面看突变体。*Fgf8型*用NBT/BCIP（紫色）和*Brachyury公司*带INT/BCIP（橙棕色）。在野生型胚胎中*Fgf8型*在原始条纹和轴旁中胚层中表达；这种表达在突变体中不存在或大大减少。比例尺显示200µm。

**图7。人类基因组中BRACHYURY结合的保护。**
（A）使用特异性抗BRACYURY IgG和非特异性对照IgG对来自分化hECS的样品进行ChIP-qPCR。图中显示了Brachyury靶区调控区的富集情况(轴2,*FGF8公司*,*JUP公司*,*WNT3A型*)和阴性对照区(*NCAPD2号机组*). 结果表示为相对于输入染色质除以非特异性对照抗体的富集。（B）人类基因组中的BRACHYURY结合。染色体坐标（hg19）下方的短红线表示PCR扩增子相对于人类基因开始的位置（蓝色）。三个底部轨迹显示了人类和小鼠、斑马鱼和脊椎动物基因组之间的基因组序列保守性（基因组浏览器，http://genome.ucsc.edu/).

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1. Wilkinson DG，Bhatt S，Herrmann BG。小鼠T基因的表达模式及其在中胚层形成中的作用。自然。1990;343:657–659.-公共医学
1. Dobrovolskaía-Zavadskaia N.Sur la mortification spontanee de la queue chez la sources nouveau-nee et Sur l’existence’un caracter（facteur）hereitaire（继承人）。C R Seances Soc生物过滤器。1927;97:114–116.
1. Naiche LA、Harrelson Z、Kelly RG、Papaioannou VE。脊椎动物发育中的T-box基因。年度版次Genet。2005;39:219–239.-公共医学
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[1] Herrmann BG、Labeit S、Poustka A、King TR、Lehrach H.小鼠中胚层形成所需T基因的克隆。自然。1990;343:617–622.-公共医学

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[3] Wilkinson DG，Bhatt S，Herrmann BG。小鼠T基因的表达模式及其在中胚层形成中的作用。自然。1990;343:657–659.-公共医学

[4] Wilkinson DG，Bhatt S，Herrmann BG。小鼠T基因的表达模式及其在中胚层形成中的作用。自然。1990;343:657–659.-公共医学

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[7] Naiche LA、Harrelson Z、Kelly RG、Papaioannou VE。脊椎动物发育中的T-box基因。年度版次Genet。2005;39:219–239.-公共医学

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[9] Yanagisawa KO，Fujimoto H，Urushihara H。Brachyury（T）突变对小鼠胚胎形态发生运动的影响。发育生物学。1981;87:242.-公共医学

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