跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2012;7（3）：e32995。
doi:10.1371/journal.pone.0032995。 Epub 2012年3月30日。

干扰素-α通过STAT1磷酸化调节谷氨酰胺酶1启动子：与HIV-1相关神经认知障碍的相关性

赵丽霞 1, 黄云龙, 长海田, 林恩泰勒, 诺曼·柯特霍斯, 王毅（Yi Wang）, 汉密尔顿·弗农, 郑嘉林
附属公司

干扰素-α通过STAT1磷酸化调节谷氨酰胺酶1启动子：与HIV-1相关神经认知障碍的相关性

赵丽霞等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

HIV-1相关神经认知障碍（HAND）在HIV-1进行性感染期间发展，影响高达50%的感染者。活化的小胶质细胞和巨噬细胞是参与HAND发病机制的关键细胞群，HAND与包括谷氨酸在内的各种可溶性神经毒性因子的产生和释放密切相关。在中枢神经系统（CNS）中，谷氨酸通常通过线粒体谷氨酰胺酶从谷氨酰胺中提取。我们以前的研究表明，谷氨酰胺酶在HIV-1感染的单核细胞衍生巨噬细胞（MDM）和小胶质细胞中上调。然而，HIV-1如何导致谷氨酰胺酶上调，或者谷氨酰胺酶的表达是如何调节的，目前尚不清楚。在本研究中，我们使用双核糖核酸酶报告分析系统证明干扰素（IFN）α特异性激活谷氨酰胺酶1（GLS1）启动子。此外，IFN-α治疗增加了信号转导子和转录激活子1（STAT1）磷酸化以及谷氨酰胺酶mRNA和蛋白质水平。IFN-α刺激GLS1启动子活性与STAT1磷酸化相关，并被抑制STAT1磷酸化的化学物质氟达拉滨降低。有趣的是，在MDM中发现STAT1直接与GLS1启动子结合，这种作用依赖于STAT1磷酸化，并通过IFN-α治疗显著增强。更重要的是，HIV-1感染增加了STAT1磷酸化和STAT1与GLS1启动子的结合，这与谷氨酸水平增加有关。尸检脑组织的研究进一步证实了这些发现的临床相关性。HIV相关性痴呆（HAD）患者的谷氨酰胺酶C（GAC，GLS1的一种亚型）mRNA水平与STAT1（p<0.01）、IFN-α（p<0.05）和IFN-β（p<0.01）相关。总之，这些数据表明，HIV-1感染和IFN-α治疗通过STAT1磷酸化和与GLS1启动子结合增加谷氨酰胺酶的表达。由于谷氨酰胺酶是HAND发病过程中谷氨酸生成增加的潜在成分，我们的数据将有助于确定治疗HAND的其他治疗靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。人GLS1启动子的构建和序列分析。
（A） ●●●●。人GLS1启动子驱动荧光素酶报告子结构示意图。该结构包含萤火虫荧光素酶编码序列（黑色），带有启动子区域（空白）和5’UTR（阴影）。显示了用于克隆的限制性内切酶。（B） ●●●●。人类GLS1启动子序列分析。TSS指定为+1。5'UTR以灰色显示。编码序列带有下划线。沿着启动子序列推测的转录因子结合位点以不同的颜色突出显示，其相应的转录因子显示在序列顶部。红色高亮显示：TATA框，深绿色：CAAT框，粉红色：AP-1，蓝色：SP-1，亮绿色：STAT，灰色：5'UTR谷氨酰胺酶；蓝色字体颜色：NF-1。
图2
图2。IFN-α特异性激活人GLS1启动子。
用人GLS1启动子构建物和pRL-SV40共同转染HEK 293T细胞。24小时后，用各种单独的细胞因子再处理24小时（A），不同剂量的IFN-α处理24小时（B），或用100U/ml的IFN-α处理不同的时间长度（C）。在（A）中，使用100U/ml IFN-α、100ng/ml IFN-γ、10ng/ml IL-1β、10ng/ml IL-6、25ng/ml IL-10、50ng/ml TRAIL或50ng/ml TNF-α。用荧光检测法测定裂解液中的荧光素酶活性。肾素荧光素酶被用作内部对照，以使转染效率正常化。数据代表三个独立实验，是三份样本的平均值。#，p<0.05，*与对照组相比，p<0.01，**，p<0.001。
图3
图3。干扰素-α需要STAT1磷酸化来激活GLS1启动子并诱导谷氨酰胺酶的表达和功能。
（A） ●●●●。用不同剂量的IFN-α处理MDM 24小时，然后用Western blot检测p-STAT1（Tyr 701）、STAT1、KGA和GAC。β-actin作为负荷对照。（B） ●●●●。使用Amplex检测细胞内谷氨酸®红色谷氨酸/谷氨酸氧化酶检测试剂盒。这些数据代表了使用三个不同供体的三个独立实验，是三份样品的平均值。（C-F）。Western blot（A）中p-STAT1（C）、STAT1。结果显示为三个不同供体（G，H）的三个独立实验的平均±SEM。显示了代表性供体中p-STAT1与GAC（G）的相关性，以及p-STAT1和KGA（H）的相关性。（I，J）。用GLS1启动子构建物和pRL-SV40共同转染HEK 293T细胞。24小时后，用1µM氟达拉滨或1:10000二甲基亚砜预处理细胞1小时，然后用或不用100 U/ml IFN-α处理细胞24小时。（一） ●●●●。Western blot检测p-STAT1和STAT1，β-actin作为负荷对照。（J） ●●●●。用荧光检测法测定裂解液中的荧光素酶活性。肾素荧光素酶用于使转染效率正常化。数据代表三个独立实验，是三份样本的平均值。#，p<0.05。*，与对照组相比，p<0.01，**，p<0.001。
图4
图4。在干扰素-α处理的MDM中，STAT1直接与GLS1启动子结合。
（A） ●●●●。人类GLS1启动子TSS中预测的STAT1结合位点被指定为+1。（B） ●●●●。用100 U/ml IFN-α处理MDM 1小时，然后使用消化的染色质、p-STAT1（Tyr 701）和STAT1抗体或IgG抗体作为阴性对照进行ChIP分析。使用特异性引物通过定量实时PCR分析纯化的DNA。免疫沉淀的DNA的量表示为相对于输入染色质总量的信号。这些数据代表了使用三个不同供体的三个独立实验。#，与对照组相比，p<0.05，*，p<0.01。（C） ●●●●。用1µM氟达拉滨或1:10000二甲基亚砜预处理MDM 1小时，然后用或不用100 U/ml IFN-α再处理一小时。如（B）所示，使用p-STAT1抗体进行ChIP分析。这些数据代表了使用两个不同供体的两个独立实验。*，与仅用二甲基亚砜治疗的对照组相比，p<0.01；#，与IFN-α和DMSO处理的细胞相比，p<0.05。
图5
图5。STAT1直接与HIV-1感染MDM的GLS1启动子结合。
（A-E）。MDM感染或未感染HIV-1美国残疾人协会持续5天。（A） ●●●●。使用p-STAT1（Tyr 701）抗体进行ChIP；IgG用作阴性对照。（B） ●●●●。对上清液进行RTase活性测试。（C） ●●●●。以β-actin为负荷对照，Western blot检测p-STAT1和STAT1。（D） ●●●●。用HPLC检测上清液中的谷氨酸。（E） ●●●●。使用Amplex检测细胞内谷氨酸®红色谷氨酸/谷氨酸氧化酶检测试剂盒。数据（A-E）代表了使用三个不同供体的三个独立实验。（F） 人类MDM感染HIV-1 5天，然后收集总RNA。通过实时RT-PCR测定IFN-α和IFN-βmRNA水平。显示的结果代表了使用三个不同供体的三个独立实验，是三份样品的平均值。（G-I）人类MDM在存在IgG或IFN-α/IFN-β中和抗体的情况下感染HIV-1 5天。收集总RNA和细胞裂解物，分别用实时RT-PCR和Western blot测定GAC mRNA（G）和蛋白（H和I）水平。为了量化，GAC表达被标准化为与β-肌动蛋白的比率，并显示为相对于IgG对照的折叠变化。与未感染MDM或IgG的对照组相比，结果（F，I）显示为三个不同供者的三个独立实验的平均±SEM，#，p<0.05，*，p<0.01，**，p<0.001。
图6
图6。HAD患者脑组织中STAT1和GAC mRNA水平之间存在显著相关性。
从HAD患者、无痴呆的HIV血清阳性患者和HIV血清阴性个体的死后脑组织中提取总RNA，并对STAT1、GAC、IFN-α2和IFN-β进行实时RT-PCR。GAPDH表达被用作内部对照。（A） STAT1水平以与GAPDH的比率进行标准化，并显示为相对于HIV血清阴性对照平均值的倍数变化。结果显示为平均值±SEM，#，p<0.05。GAC与STAT1（B）、IFN-α2（C）和IFN-β（D）mRNA水平的相关性通过Spearman相关性测定。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Kraft-Terry SD、Buch SJ、Fox HS、Gendelman HE。多种颜色的外套：人类免疫缺陷病毒感染中的神经免疫串扰。神经元。2009;64:133–145.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 朱利安D，瓦卡K，努南CA。感染HIV-1的单核吞噬细胞分泌神经毒素。科学。1990;250:1593–1596.-公共医学
    1. Jiang ZG，Piggee C，Heyes MP，Murphy C，Quearry B等。谷氨酸是活化的HIV-1感染巨噬细胞分泌物中神经毒性的介质。神经免疫学杂志。2001;117:97–107.-公共医学
    1. Kaul M，Garden GA，Lipton SA。HIV-相关痴呆症中神经元损伤和凋亡的途径。自然。2001;410:988–994.-公共医学
    1. Newcomb R、Sun X、Taylor L、Curthoys N、Giffard RG。神经元死亡后线粒体谷氨酰胺酶增加细胞外谷氨酸的生成。生物化学杂志。1997;272:11276–11282.-公共医学

出版物类型

MeSH术语