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.2012年3月15日；26(6):542-7.
doi:10.1101/gad.184184.111。

COMA/CENP-H/I/N动粒蛋白在纺锤体检查点中的保守作用

丹尼尔·马特森 1, Pinar B除雾器, P托德·斯图肯伯格, 丹尼尔·J·伯克
附属公司

COMA/CENP-H/I/N动粒蛋白在纺锤体检查点中的保守作用

丹尼尔·马特森等。 基因开发. .

摘要

COMA/CENP-H/I动粒复合体调节动粒处的微管动力学。在Aurora B活性受损的条件下，该复合物还需要在酵母和人类细胞中产生纺锤体检查点信号。我们的数据解释了为什么用极光抑制剂治疗的哺乳动物细胞仍然具有功能性纺锤装配检查点（SAC），因为检查点信号通过CENP-H/I/N。SAC信号减弱不能解释CENP-H/I/N复合物耗尽的SAC效应，该复合物在SAC对紫杉醇的反应中没有作用。我们提出了一个模型来解释人类细胞对诺可达唑和紫杉醇的不同反应。

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数字

图1。
图1。
SGA分析确定COMA建筑群是占用检查点的组成部分。(A类)重新起泡试验。将细胞置于YPD和YPD+Ben（70μg/mL）上以耗尽Cdc6，然后进行延时摄影。有丝分裂细胞在30°C下9小时后出现双芽。(B类)SGA分析。单个突变体orf:：KanMX(左边side）和双突变体(正确的侧边）镀在YPD上+15μg/mL苯甲酸。有趣的突变体显示出作为单个突变体的更多生长（>>）。(C类)苯甲酰敏感性。在23°C下，将饱和培养物的十倍稀释液滴在YPD+DMSO和YPD+15μg/mL苯甲酸上4 d。(D类)细胞的延时摄影，如A类在葡萄糖+Ben（70μg/mL）上生长。
图2。
图2。
CTF3型SAC活动需要。在有或无微管的情况下，将所示基因型的α-因子受体细胞释放到细胞周期中。每20分钟取样一次，进行免疫印迹和流式细胞仪分析。用SDS-PAGE分离蛋白提取物，并用小鼠单克隆抗HA（12CA5）和抗PGK1抗体进行免疫印迹，以鉴定Pds1和PGK1。
图3。
图3。
CENP-I的耗尽会削弱ZM447439处理的HeLa细胞在诺可唑中的阻滞能力。(A类)CENP-H、CENP-I或CENP-N缺失的HeLa细胞以对极光激酶抑制敏感的方式增加了基础有丝分裂指数。补充图5显示了耗竭的蛋白质斑点。即使CENP-H的适度耗竭也会导致有丝分裂指数显著增加，而这一指数易受极光激酶抑制的影响。(*) 0.02; (**) 0.005. (B类)用ZM447439处理1小时后，CENP-I siRNA-处理的HeLa细胞在诺卡唑的存在下退出有丝分裂，而LacZ对照细胞保持停滞状态。(C类)诺康唑处理的CENP-I缺失HeLa细胞对ZM447439的有丝分裂反应呈剂量依赖性。(D类)HeLa全细胞裂解物的蛋白质印迹显示CENP-I耗竭的程度。
图4。
图4。
CENP-I缺失的HeLa细胞在诺克唑存在下对极光B抑制敏感，但与低剂量紫杉醇的对照细胞相似。(A类)CENP-I缺失的HeLa细胞经Hesperadin或ZM447439处理后，在抑制50%Aurora B活性的浓度下，有丝分裂指数也会出现类似的降低。在3.3μM或0.33μM诺卡唑中滞留的细胞数量相似。(B类)用0.33μM或3.3μM诺卡唑处理后，LacZ或CENP-I siRNA-处理的HeLa细胞的抗tubulin IF，证明需要3.3μM的诺卡唑才能完全解聚细胞微管蛋白。(C类)CENP-I缺失的HeLa细胞在与对照组相似的紫杉醇浓度下停止生长。
图5。
图5。
CENP-I缺失会改变检查点成分的水平，并刺激动粒处的极光激酶活性。(A类)CENP-I缺失的HeLa细胞可以定位外动粒的组成部分，以及关键的检查点蛋白BubR1，并降低Mad1和Mad2的水平。(B类)定量IF表明，CENP-I的耗竭导致动粒的CENP-A和Hec1水平略有下降，而动粒的Mad1和Mad2水平显著降低。有趣的是，尽管动粒的BubR1和Aurora B水平没有变化，但Aurora B底物p（S7）CENP-A的水平显著升高。(*)P（P）= 0.0031; (**)P（P）=0.61。(C类)紫杉醇和诺卡唑刺激的通路模型。详见正文。
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