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.2012;7（3）：e33177。
doi:10.1371/journal.pone.0033177。 Epub 2012年3月8日。

谷氨酰胺对DNA损伤、β-淀粉样蛋白和H2O2诱导的应激起神经保护作用

陈建民 1, 卡尔·赫鲁普
附属公司

谷氨酰胺对DNA损伤、β-淀粉样蛋白和H2O2诱导的应激起神经保护作用

陈建民等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

谷氨酰胺是人体血液中最丰富的游离氨基酸，对细胞“条件必需”。其细胞内水平受通过特定运输系统摄取细胞外谷氨酰胺和谷氨酰胺合成酶（GS）在细胞内合成的调节。当细胞外谷氨酰胺减少时，GS蛋白水平升高，增加了调控的复杂性。不幸的是，这种过量的GS可能是不适应的。GS过度表达具有神经毒性，尤其是当细胞处于低谷氨酰胺介质中时。同样，在低谷氨酰胺中，多种应激反应蛋白水平降低，使细胞对H（2）O（2）、锌盐和DNA损伤过敏。这些改变的反应可能与衰老的神经退行性疾病特别相关。阿尔茨海默病（AD）患者大脑中GS活性和谷氨酰胺水平较低，部分AD海马神经元与对照组相比GS水平显著升高。我们通过显示培养基中谷氨酰胺水平的升高可以保护培养的神经元细胞对抗淀粉样肽Aβ，从而验证了这些观察的重要性。此外，在两种不同的家族性AD小鼠模型中，为期10天的谷氨酰胺饮食补充减少了炎症诱导的神经元细胞周期激活、tau磷酸化和ATM激活，同时提高了两种突触蛋白VAMP2和突触素的水平。总之，我们的观察结果表明，健康的神经细胞需要细胞内和细胞外的谷氨酰胺，补充谷氨酰胺的神经保护作用可能对AD的治疗有益。

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数字

图1
图1。剥夺外源性和内源性谷氨酰胺协同促进神经细胞死亡。
A–D）在四种不同的培养基中培养初级神经元。A） 正常；B） 谷氨酰胺合成酶（GS）抑制剂蛋氨酸亚砜（MSO）存在下的正常谷氨酰胺；C） 不含谷氨酰胺；D） 无谷氨酰胺+MSO。2–3天后，对细胞进行Map2（红色）和裂解caspase-3（绿色）免疫染色，放大200倍拍摄照片。E） 细胞计数显示凋亡神经元（Caspase-3染色）与总细胞计数（DAPI染色）的比率。误差线对应标准偏差；*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图2
图2。谷氨酰胺缺乏上调GS表达。
A） 在AD患者中检测到GS免疫阳性海马神经元，但在对照样品中未检测到。免疫阳性星形胶质细胞存在于两者中。B） AD额叶皮层GS水平显著高于对照组。显示了两种不同暴露时间下的一个代表性斑点。C） 对12例AD和8例对照病例进行量化和统计。对照组中的GS水平被任意设置为100%。误差线表示标准偏差。通过Student T检验计算P值。D） 从培养基中去除谷氨酰胺或用MSO抑制GS活性可诱导初级神经元表达GS。E） 从培养基中去除谷氨酰胺可促进N2a细胞中GS的表达。
图3
图3。在缺乏外源谷氨酰胺的情况下，GS的过度表达增强了神经退行性变。
A） GS过度表达导致分化N2a细胞的突起退化，而低活性突变体GSR341C型似乎没有同样的效果。B） 野生型和突变型GS过度表达都会增加基础条件下和压力测试下（包括0.1 mM H）的凋亡标记物水平（caspase-3和caspase-6的裂解）2哦2100 nM Aβ和20µM足叶乙甙。突变体GSR341C型效果始终低于GS重量C）蛋白质印迹显示在培养基中存在或不存在游离谷氨酰胺的情况下GS过表达的作用。磷酸化-RB抗体提供了同时增强细胞周期（增加全长P-RB）和细胞死亡（caspase-3裂解RB，P-RB*）的证据。D） 面板C中所示的4次重复实验的量化。误差条表示标准偏差* = p<0.05** = p<0.01（通过学生的T检验）。E） 通过LDH分析评估细胞死亡。用1mM H处理过表达野生型GS和GS（R341C）的N2a细胞2哦230分钟，然后在含有或不含谷氨酰胺的新鲜培养基中恢复6小时，然后进行LDH分析。误差线表示标准偏差* = p<0.05。
图4
图4。没有谷氨酰胺，应激反应会受到影响。
A） 用不同的细胞应激源处理N2a细胞30分钟，然后收集并进行Western blots分析。右侧显示了各种应激反应蛋白，文中对此进行了更详细的描述。P-ATM=P（P）S1981-自动取款机。B） 用5µM足叶乙甙处理N2a细胞30分钟以诱导DNA损伤。去除足叶乙甙，并添加含有或不含谷氨酰胺的新鲜培养基。在指定的时间点收集细胞进行Western blot分析。Gln−=无谷氨酰胺培养基；Gln+=2 mM含谷氨酰胺的培养基。C） 对为面板B所示实验收集的部分样品进行彗星分析。在每个面板中，箭头指向插图中放大倍率较高的代表性细胞。对照组培养物中很少有彗尾。然而，在足叶乙甙作用30分钟后，典型细胞出现了发育良好的彗尾，表明DNA受到了损伤。恢复4小时后，在含有或不含谷氨酰胺的培养物中，大多数彗尾消失，但在缺乏谷氨酰胺的培育物中发现更多的核固缩。D） 作为细胞死亡量度的脓细胞核计数。对于每种情况，在显微镜下检查250个随机选择的细胞；细胞被分为四类：正常核、起泡核、浓缩核和核物质消失。E） 通过LDH分析评估细胞死亡。用1 mM H处理的N2a电池2哦230分钟，并在新鲜介质中恢复6小时。LDH活性通过490 nM的反应吸光度测量，以650 nM的吸光度作为参考。**表示p<0.01，误差线=标准偏差。F） MTT法评估细胞活力。细胞被视为E，但允许在MTT分析之前恢复24小时（570 nm处的吸光度，650 nm处的参考值）。**表示p<0.01，误差线=标准偏差。
图5
图5。谷氨酰胺含量低的神经元对Aβ的神经毒性作用更敏感。
A） 在不含谷氨酰胺的培养神经元中，ATR水平显著降低。ATM和53BP1的减少量相似，但分析中的可变性使这些变化保持在趋势水平，而不是显著差异。3次重复实验的平均值；误差条表示标准偏差，*=p<0.05。B） 在含有或不含谷氨酰胺的Neurobastic培养基中培养9天（DIV9）的神经元，用20µM足叶乙甙处理30分钟，然后用活化caspase 6染色（绿色）进行免疫染色，并用DAPI（蓝色）进行复染。C） β诱导的初级神经元tau磷酸化依赖于培养液中谷氨酰胺的状态。D） 尽管总τ（3R）水平保持不变，但谷氨酰胺以浓度依赖的方式抑制Tau磷酸化。E） 在缺乏谷氨酰胺的情况下，用Aβ处理的老年神经元有更多的突起变性（呈串珠状的Map2染色树突）。F） 谷氨酰胺存在时突触体素染色增强。每个面板中的数字是指培养基中谷氨酰胺的浓度（mM）。
图6
图6。补充谷氨酰胺对AD小鼠模型神经元的保护作用体内.
用LPS对R1.40和8.9 AD小鼠模型进行免疫激发，以增强退化表型。A） 补充谷氨酰胺的小鼠的小胶质细胞激活受到抑制。每列顶部显示了两个不同的大脑区域。小胶质细胞用Iba-1抗体染色。与静止的小胶质细胞相比，活化的小胶质瘤突起更厚、更短。B） Western blot显示补充谷氨酰胺（Gln+）的保护作用：更低的tau磷酸化（AT8）、更少的细胞周期重入（PCNA）、更低的ATM激活（P-ATM）和更多的突触维持蛋白（VAMP2和突触素）表达。C） 对B组显示的蛋白质印迹进行量化，并分析对照组和谷氨酰胺补充组之间的统计显著性，*表示p<0.05。D） 免疫荧光图像显示，补充谷氨酰胺的动物皮层神经元中的细胞周期蛋白A染色较少。
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