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。2012年4月6日；287(15):11704-16.
doi:10.1074/jbc。M111.299131。 Epub 2012年2月18日。

RED是一种纺锤体极相关蛋白，是MAD1的动粒定位、有丝分裂进展和纺锤体组装检查点激活所必需的

裴志业（Pei-Chi-Yeh） 1, Chang-Ching Yeh公司, 陈毅（Yi Cheng Chen）, 岳丽娟
附属公司

红细胞是纺锤体极相关蛋白，是MAD1动粒定位、有丝分裂进程和纺锤体组装检查点激活所必需的

裴志业（Pei-Chi-Yeh）等。 生物化学杂志。 。

摘要

纺锤体组装检查点（SAC）对于确保动粒正确附着在纺锤体上，从而在有丝分裂期间精确分离成对姐妹染色单体至关重要。SAC蛋白被招募到未附着的动粒中，以激活前中期的SAC。然而，SAC的激活是否也需要不定位于动粒的蛋白质，研究较少。在这里，我们表明核蛋白RED（也称为IK）是人类白细胞抗原（HLA）II的下调因子，与人类SAC蛋白MAD1相互作用。MAD1中确定的两个RED相互作用区域来自氨基酸残基301-340和439-480，分别命名为MAD1（301-340）和MAD1。我们的观察结果表明，RED是一种纺锤极相关蛋白，在中期和后期与MAD1在纺锤极共定位。RED的耗竭可导致有丝分裂时间缩短，MAD1在前中期动粒定位失败，SAC缺陷。此外，与增强型绿色荧光蛋白融合的RED相互作用肽MAD1（301-340）和MAD1。综上所述，我们认为RED是MAD1动粒定位、有丝分裂进程和SAC激活所必需的。

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数字

图1。
图1。
抗MAD1和RED（A）的抗体。异步HeLa细胞裂解物经SDS-PAGE处理，并使用亲和纯化的大鼠抗MAD1或兔抗RED抗体作为探针进行Western印迹。B类，早期S期和M期RED的蛋白质水平。用双胸苷处理细胞(DT公司; 胸腺嘧啶，2米米)在S期早期阻断，或在M期用诺卡唑（Noc，50 ng/ml）阻断。从皮氏培养皿中摇出诺可唑阻滞的有丝分裂细胞，并收集用于蛋白质印迹分析。异步细胞裂解物(Asn公司)用于比较。使用50微克细胞裂解物与抗RED、MAD1、细胞周期蛋白B1、安全蛋白和β-微管蛋白抗体进行免疫印迹（负荷控制）。收集细胞，用冷乙醇固定，用碘化丙啶染色，通过流式细胞仪分析测定DNA含量。
图2。
图2。
MAD1与RED结合。 A类和B类，MAD1绑定到红色体外试验。A类，纯化的GST-MAD1与His HA RED相互作用。纯化的GST(G公司)或GST-MAD1(M（M）)重组融合蛋白与纯化的His-HA-RED孵育(R（右）)重组蛋白在RIPA缓冲液中，并在4°C下用谷胱甘肽-脑葡萄糖珠沉淀。沉淀蛋白通过免疫印迹分析(IB公司). 纯化的His-HA-RED(R（右）)加载重组蛋白作为输入对照。B类，亲和纯化的EGFP-MAD1与His-HA-RED相互作用。亲和纯化EGFP(G公司)或EGFP-MAD1(M（M）)融合蛋白与纯化的His-HA-RED重组蛋白孵育（见“实验程序”）。用免疫印迹法分析沉淀蛋白。纯化的EGFP、EGFP-MAD1和His-HA-RED重组蛋白作为输入对照。C类和D类，MAD1绑定到红色体内将诺卡唑抑制的有丝分裂细胞在缺乏诺卡唑的新鲜培养基中摇晃并释放，持续约40分钟。再次收集有丝分裂的细胞进行共免疫沉淀分析和流式细胞仪DNA含量分析。约2 mg细胞裂解物用于免疫沉淀(IP（IP）)分析。免疫印迹法检测免疫沉淀蛋白。C类用有丝分裂细胞裂解物中的蛋白G珠与纯化的兔抗MAD1抗体共免疫沉淀RED。纯化兔非免疫(非我)抗体作为对照。加载80微克细胞裂解物作为输入控制。星号表示兔IgG轻链。D类，使用来自有丝分裂细胞裂解物的G蛋白珠与纯化的兔抗RED抗体共免疫沉淀MAD1。加载45μg细胞裂解物作为输入控制。
图3。
图3。
酵母双杂交分析和GST下拉分析用于鉴定MAD1中的RED相互作用区域。 A类，MAD1及其截断等位基因的示意图，用于定义酵母双杂交分析中的RED相互作用区域。将全长MAD1与酵母Gal4转录因子的DNA-BD融合，将RED与酵母Gal 4的AD融合。将一系列MAD1截短蛋白融合到Gal4转录因子的DNA-结合域，以确定MAD1的RED相互作用区域。合成葡萄糖最小固体培养基(标准偏差)缺乏亮氨酸和色氨酸(SD/-长/-宽)用于培养酵母转化子，SD培养基缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸，含有25 m米3-氨基三唑(SD/-长/-宽/-高/+3AT公司)用于测定HIS3型报告基因+，各种MAD1截短蛋白与RED的相互作用，没有交互作用。这个封闭式盒子表示MAD2结合区域。B类确认MAD1（301–340）和RED之间的相互作用。BD-RED和AD-MAD1（301-340）载体均用于酵母双杂交分析。C类、MAD1（301–340）和MAD2（439–480）绑定到红色在体外.净化GST(G公司)，GST-MAD1（232-340）(1)，GST-MAD1（439–480）(2)和GST-MAD1（301-340）(三)在RIPA缓冲液中与纯化的His-HA-RED重组蛋白孵育，并在4°C下与谷胱甘肽结合的Sepharose珠沉淀。沉淀蛋白通过免疫印迹分析(IB公司). 装载纯化的His-HA-RED重组蛋白作为输入对照(N个)。
图4。
图4。
红细胞的细胞内定位。 A类在中期和后期，MAD1和RED在纺锤体两极共定位。用多聚甲醛固定细胞，同时用大鼠抗MAD1和兔抗RED抗体染色，然后用Cy3-结合的抗鼠IgG和FITC-结合的抗兔IgG抗体染色。染色体DNA用DAPI染色。用激光共聚焦显微镜观察染色细胞。这个箭头指示主轴极的位置。比例尺=10微米。B类，在主轴极处定位RED。细胞用冷甲醇固定，同时用兔抗RED抗体和鼠抗γ-微管蛋白抗体染色，然后用FITC-偶联抗兔IgG和Cy3-偶联抗鼠IgG抗体染色。箭头指示主轴极的位置。比例尺=10微米。
图5。
图5。
RED RNAi对SAC的影响。模拟处理HeLa细胞(国会议员)或转染非沉默(NS公司)siRNA或红色siRNA#1或#2，在使用（+）或不使用（-）诺卡唑治疗前24小时。对于每次转染，使用200 pmol的siRNA双工体。在使用或不使用诺康唑治疗后收集细胞进行分析(国家石油公司)持续18小时。A类，RED蛋白缺失。用抗RED、MAD1、cyclin B1、securin和β-微管蛋白抗体（负荷控制）对细胞进行裂解和蛋白质印迹分析。B类模拟、非沉默siRNA、红色siRNA#1或红色siRNA#2处理细胞培养物中有丝分裂细胞的定量。三个独立实验中的每一个都对200个细胞进行了评分。图中显示的数据是三个独立实验的平均值±S.D.。*，第页< 0.001; **,第页<0.001（方差分析）。C类流式细胞术分析模拟、非沉默siRNA、RED siRNA#1或RED siRNA#2处理细胞的DNA含量直方图。D类，MAD1在RED缺失的前中期细胞中的定位。如图4所示，对MAD1和RED进行染色A.比例尺=10微米。
图6。
图6。
RED RNAi对有丝分裂进程的影响。用指示的siRNA双链转染H2B-GFP-HeLa细胞，然后用胸苷将其阻滞在早期S期。从早期S期阻滞中释放细胞，使用活细胞延时荧光显微镜测量有丝分裂时间。NEBD被指定为T0从NEBD到后期的时间是从实时细胞电影中测量的。A类,C类、和E类，每5分钟从转染有指定siRNA双工体的H2B-GFP-HeLa细胞的活细胞视频中连续帧。B类,D类、和F类，转染有指示siRNA双链的H2B-GFP-HeLa细胞的有丝分裂进程。随机选择的每组细胞的计时如所示图。N个，从两个独立实验中随机选择的细胞数。
图7。
图7。
MAD1及其衍生物异位表达对红细胞在SAC中作用的影响。细胞被转染IRES-EGFP公司(1),IRES-EGFP-MAD1型(2),IRES-EGFP-MAD1（301-340)(三)或IRES-EGFP-MAD1（439–480)(4). 每次转染时，使用300 ng质粒DNA。A类EGFP-MAD1、EGFP-MAMD1（301–340）和EGFP-MMAD1（439–480）的细胞内定位。对细胞进行DNA、EGFP融合蛋白和RED染色。箭头指示主轴极。比例尺，10微米。B类RED与EGFP-MAD1（301–340）和EGFP-MAMD1（439–480）的关联。使用GFP-Trap®_A珠对细胞进行共免疫沉淀分析。沉淀蛋白通过免疫印迹分析(IB公司)。C类SAC中EGFP-MAD1（301–340）和EGFP-MAD1（439–480）的适度表达的影响。转染24h后，用二甲基亚砜或诺卡唑处理细胞18h，然后收集分析。在三个独立的实验中，每个实验都对200个GFP阳性细胞进行评分。数据显示在图表是三个独立实验的平均值±S.D.。*，第页< 0.001; **,第页< 0.001; ***,第页=0.038（方差分析）。
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参考文献

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