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.2012年2月19日；14(3):276-86.
doi:10.1038/ncb2432。

慢性淋巴细胞白血病患者胱氨酸代谢的基质控制促进癌细胞存活

万章 1, Dunyaporn Trachootham公司, 刘进云（Jinyun Liu）, 陈刚（音译）, 海伦·佩利卡诺, 西莉亚·加西亚-普利托, 魏勤路, Jan A汉堡, 卡洛·克罗斯, 威廉·普朗基特, 迈克尔·基廷, 彭黄
附属公司

基质控制胱氨酸代谢促进慢性淋巴细胞白血病癌细胞存活

万章等。 Nat细胞生物学. .

摘要

组织基质细胞与白血病细胞相互作用，深刻影响其生存能力和药物敏感性。这里我们展示了骨髓基质细胞调节慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞氧化还原状态并促进细胞存活和耐药性的生化机制。由于Xc-转运体的低表达水平，患者的原代CLL细胞运输胱氨酸用于谷胱甘肽（GSH）合成的能力有限。相反，骨髓基质细胞有效地导入胱氨酸并将其转化为半胱氨酸，然后释放到微环境中，供CLL细胞摄取，以促进GSH合成。GSH水平升高可提高白血病细胞的存活率，并保护其免受药物诱导的细胞毒性。此外，禁用这种保护机制可以显著提高CLL细胞对基质环境中药物治疗的敏感性。这种基质-白血病相互作用对CLL细胞存活至关重要，是有效靶向白血病细胞克服体内耐药性的关键生化途径。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性金融利益

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1。骨髓基质细胞促进CLL细胞GSH合成并缓解ROS应激
（A）比较单独培养或与骨髓基质细胞（HS5）培养3天的CLL细胞活力。用annexin-V/PI染色测定细胞活力。这些数字表明有%的活细胞（膜联蛋白-V/PI双阴性）。这些数据代表了使用不同CLL样本的3个实验。（B）单独培养或与HS5细胞共同培养的CLL细胞中GSH含量的时间进程。数值为使用3个CLL样品的3个单独实验的平均值±SD。（C）比较单独培养或与HS5细胞共同培养72 h的CLL细胞中的GSH水平。条形图显示了35个不同CLL样品的平均值±SEM，每个样品测量三次。（***，p<0.001）。（D）通过流式细胞术分析检测单独培养或与HS5细胞一起培养（72小时）的CLL细胞中细胞ROS和硫醇含量。显示了20个CLL样本的代表性直方图和平均值±SD的定量比较（*，p<0.05；**，p<0.01）。（E）HS5基质细胞保护CLL细胞免受H诱导的自发凋亡和细胞死亡2O（运行）2（100μM）。用annexin-V/PI染色测定细胞活力。每个点杂交中的数字表示来自3个不同CLL样本的活细胞（膜联蛋白-V/PI双阴性）的平均百分比。（F）单独或与不同骨髓基质细胞（HS5、StromaNKtert、KUSA-H1）培养3天后CLL细胞中GSH水平的比较。每个条形图显示GSH含量的平均值±SD（n=6个CLL样品）。（G）与基质细胞（HS5、StromaNKtert和KUSA-H1）共培养后，CLL细胞中ROS降低。使用1μM DCF-DA通过流式细胞术检测细胞ROS。显示了4个CLL患者样本的4个单独实验的代表性直方图和平均值±SD（***，p<0.001）。
图2
图2。谷胱甘肽在介导CLL细胞自发性和药物诱导细胞死亡基质保护中的关键作用
（A）在存在或不存在F-ara-A（20μM）或奥沙利铂（20μM）的情况下，骨髓基质细胞（HS5）对CLL细胞的保护作用。CLL细胞与HS5细胞预培养24 h，然后药物暴露48 h。细胞活力通过annexin-V/PI双重染色测定。CLL样本的代表性点图显示在左侧面板上；数字表示活细胞的%（膜联蛋白-V/PI双阴性）。补充图S3A显示了其他6个患者样本的数据。右侧面板显示了来自7个CLL样本的数据的平均值±SD。*，p<0.05。（B）HS5基质细胞或外源性N-乙酰半胱氨酸（NAC）增加CLL细胞活力。CLL细胞单独培养，与HS5细胞或1 mM NAC共同培养，如图所示。通过流式细胞仪分析测定细胞活力（平均值±SD，每种情况下n=3个CLL样品）。（C）在不含基质细胞的培养基中通过外源性GSH保护CLL细胞（7天）。这些数据代表了3个实验。右侧面板显示了在培养基中与指定浓度的GSH孵育的CLL细胞中的谷胱甘肽含量。(D类)在有无PEITC（5μM，5 h）的情况下，测定单独培养或与HS5细胞一起培养的CLL细胞中的总巯基水平。使用巯基活性染料CMFDA通过流式细胞术测量细胞巯基。显示了3个独立实验的代表性历史记录。（E）在有或无F-ara-A（20μM，48 h）、奥沙利铂（20μM，48 h。每个斑点印迹中的数字表示活细胞的%。右边的条形图显示了使用10–30个不同的慢性淋巴细胞白血病患者样本进行的多个实验中活细胞的平均值±SD，如图所示。*，p<0.05。
图3
图3。基质培养基的低分子量部分增强了CLL细胞中GSH的合成并促进了细胞存活
（A）比较单独培养的CLL细胞或与HS5细胞在存在或不存在跨膜的情况下培养的细胞活性的药物诱导丧失。F-ara-A:20μM，48小时；奥沙利铂：20μM，48小时；H（H）2O（运行）2：100μM，24 h。通过annexin-V/PI染色测量细胞活力（平均值±SD；n=3；*，p<0.05）。（B）在常规培养基或HS5条件培养基（HS5-CM）中培养72小时后，CLL细胞中GSH水平的比较**，p<0.01（平均值±SD；n=3个不同的CLL样本）。（C）在常规培养基或HS5条件培养基中培养1或7天后，用Annexin V-PI测定CLL细胞的活力。每个斑点印迹中的数字表示活细胞的%（膜联蛋白-V/PI双阴性）。条形图显示了使用3个CLL样本的3个单独实验的平均值±SD，*，p<0.05。（D）将HS5条件培养基分离为高分子量（HMW）和低分子量（LMW）组分及其对暴露于奥沙利铂（20μM，48 h）的CLL细胞活性的影响。用annexin-V/PI染色测定细胞活力。右侧条形图显示了使用3-5个CLL患者样本进行的多次实验的平均值±SD，如图所示。*，p<0.05。（E）HS5条件培养基或其LMW组分提高CLL细胞中GSH水平。每个条形图显示了使用3个CLL样本的3个实验的平均值±SD。（F）比较CLL细胞或与HS5细胞培养或不培养72h的培养基中的GSH水平。显示了3个CLL样品的3个实验的平均值±SD的柱状图（**，p<0.01）。（G）比较CLL细胞或有或无HS5细胞培养72h的培养基中的硫醇水平。使用终点法测量硫醇水平，如方法所述。显示了3个CLL患者样本的3个实验的平均值±SD条形图（*，p<0.05；**，p<0.01）。
图4
图4。骨髓基质细胞产生半胱氨酸对增强CLL细胞中GSH的合成和促进其生存至关重要
（A）使用三重四极杆质谱仪LC-MS/MS（Agilent 6460）定量三种骨髓基质细胞系条件培养液中的半胱氨酸。新鲜收集培养基并立即进行分析。以不含基质细胞的培养基为对照。将所有样本分为三份进行分析。左侧面板是显示该分析线性的标准曲线。LC-MS/MS光谱如补充图S5所示。（B）半胱氨酸对无基质细胞培养的CLL细胞存活和药物敏感性的影响。每天向培养基中添加指示浓度的半胱氨酸。第7天，添加F-ara-A或奥沙利铂，再培养48小时。第9天，通过流式细胞仪分析测定细胞活力。显示了3个单独实验的代表性点图。（C）细胞外半胱氨酸（50μM，每天添加3天）增加CLL细胞GSH含量。将单独培养或与HS5细胞共同培养的CLL细胞作为对照进行比较。每个条形代表4个单独实验的平均值±SD（***，p<0.001）。（D）2-巯基乙醇（2-ME，20μM）将胞外胱氨酸转化为半胱氨酸可促进CLL细胞中GSH的合成（平均值±SD；n=3个不同的CLL样品；***，p<0.001）。（E）在常规RPMI培养基（含200μM胱氨酸）中，2-ME（20μM）将培养基中的胱氨酰转化为半胱氨酸可促进CLL细胞的长期存活。在第20天使用annexin-V/PI双重染色进行细胞活性的照片和流式细胞术分析。每个面板下方显示了3个单独实验的平均值±SD（活细胞百分比）。（F）当从培养基中提取胱氨酸时，2-ME不能保护CLL细胞。细胞存活率采用annexin-V/PI双重染色法进行测量，每个面板下方显示了3个单独实验的平均值±SD（活细胞百分比）。
图5
图5。白血病细胞（CLL）直接利用胱氨酸的能力很低，并且依赖基质细胞将胱氨酰转化为半胱氨酸以合成谷胱甘肽
（A）胱氨酸转运体xCT在HS5（H）、StromaNKtert（N）、KUSA-H1（K）间质细胞和患者原代CLL细胞中的表达（N=10）。未裁剪的印迹显示为补充信息。（B）的比较[14C] HS5基质细胞和CLL细胞对胱氨酸的摄取（培养4小时）。显示了3个单独实验的平均值±SD条形图（***，p<0.001）。（C）有效吸收[14C] 半胱氨酸，但不是[14C] CLL细胞的胱氨酸（培养4 h；平均值±SD；n=3个患者样本；***，p<0.001）。（D）基质细胞（HS5）增加了CLL细胞在含有[14C] 胱氨酸（培养6小时；平均值±标准偏差；n=3个患者样本；***，p<0.001）。（E）基质细胞需要胞外胱氨酸来增强CLL细胞中GSH的合成。CLL细胞与HS5细胞在200μM胱氨酸存在或不存在的情况下共培养72 h，并测量CLL细胞提取物中的GSH含量（平均值±SD；n=3个患者样本；*，p<0.05；**，p<0.01）。
图6
图6。通过耗尽白血病细胞中的谷胱甘肽或阻断基质细胞摄取胱氨酸克服CLL细胞中基质诱导的耐药性
（A）PEITC（5μM）对单独培养或与StromaNktert（左图）或KUSA-H1基质细胞（右图）在有或无F-ara-A或奥沙利铂的情况下培养的CLL细胞活力的影响。共同培养的CLL细胞暴露于F-ara-A（20μM）或草酸铂（20μM）48 h。在培养的最后5 h内添加PEITC（5μM）。通过膜联蛋白-V/PI测定分析细胞活力。条形图显示了使用6个CLL样本的6个单独实验的平均值±SD。（B）PEICT对染色体17p缺失的CLL患者耐药白血病细胞的影响。在20μM F-ara-A或20μM奥沙利铂存在或不存在的情况下，单独或与KUSA-H1基质细胞培养CLL细胞48小时。在培养的最后5小时内添加PEITC（10μM）。数字显示有%的活细胞。（C）通过（S）-4-羧基苯基甘氨酸（S-4-CPG）抑制胱氨酸转运，使CLL细胞对F-ara-A和草酸铂敏感。首先用S-4-CPG（500μM）孵育共培养的CLL和HS5细胞24小时，然后暴露于F-ara-A（20μM）或草酸铂（20μM）48小时。细胞活力通过annexin-V/PI分析进行分析。代表性的点图显示了%的活细胞（annexin-V/PI双阴性）。右侧面板显示了3个单独实验的平均值±SD。（D）通过使用柳氮磺胺吡啶（SSZ）抑制胱氨酸转运，使CLL细胞对F-ara-A和草酸铂敏感。先用SSZ（300μM）孵育CLL和基质（KUSA-H1）细胞24 h以抑制胱氨酸转运，然后暴露于F-ara-A（20μM）或草酸铂（20μM）48 h。流式细胞仪分析细胞活力。代表性的点图显示了%的活细胞。右侧面板显示了使用3个CLL患者样本的3个单独实验的平均值±SD。
图7
图7。通过阻断基质细胞摄取胱氨酸消除谷胱甘肽对CLL细胞的保护作用体内
（A）柳氮磺胺吡啶（SSZ）对CLL细胞GSH的影响体内CLL细胞通过腹腔冲洗从患有CLL病的Tcl-1转基因小鼠腹腔内白血病细胞中获得。在7天的恢复期后，给小鼠注射SSZ（8 mg/小鼠，i.p.，每12 h x 3次注射）。在最后一次SSZ治疗12小时后获得第二份腹膜CLL细胞样本。GSH的测量如方法所述（平均值±SD；n=3；**，p<0.01）。（B）SSZ对CLL细胞GSH的影响在体外没有基质细胞。原代CLL细胞培养过夜，以去除附着在烧瓶表面的基质细胞。将悬浮的CLL细胞转移到新鲜烧瓶中，并在有或无SSZ的情况下培养（100–300μM，24 h）。GSH测量一式三份（平均值±SD；n=3）。（C）用SSZ（8 mg/kg，i.p.，每周3次，M/W/F）治疗Tcl-1小鼠可显著降低白血病细胞负荷。左表中的数字显示了SSZ治疗前后每只小鼠腹腔内白血病细胞总数；右条形图显示了所有4只受试小鼠白血病细胞的平均值±SD。（D）SSZ对Tcl-1小鼠的治疗降低了白血病细胞存活率并提高了药物敏感性体外受精（a）通过腹腔冲洗从CLL小鼠中分离出白血病细胞。在培养细胞前后分析细胞活力体外受精如图所示，使用F-ara-A或奥沙利铂。（b） 给同一只小鼠7天的恢复期，然后用SSZ治疗（8 mg/kg，i.p.，每周三次，M/W/F）。最后一次药物治疗后24小时，分离CLL细胞，并在细胞培养前后分析细胞活力体外受精如图所示，使用F-ara-A或奥沙利铂。（c） 实验条件与（b）相同，只是CLL细胞与骨髓基质细胞（StromaNKtert）共同培养。
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