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.2012年3月7日；31(5):1095-108.
doi:10.1038/emboj.2012.32。 Epub 2012年2月17日。

溶酶体-细胞核信号机制通过mTOR和TFEB感应和调节溶酶体

卡明·塞滕布雷 1, 罗伯托·佐恩库, 迭戈·L·麦地那, 弗朗西斯科·维特里尼, 塞尔坎·埃尔丁, SerpilUckac埃尔丁, Tuong Huynh公司, 马修·费隆, 卡尔桑迪, 米歇尔·维拉德, 瓦莱丽亚·法奇内蒂, 大卫·M·萨巴蒂尼, 安德烈亚·巴拉比奥
附属公司

溶酶体-细胞核信号机制通过mTOR和TFEB感应和调节溶酶体

卡明·塞滕布雷等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

溶酶体通过控制细胞清除率和能量生成来响应环境提示，在细胞内稳态中发挥关键作用。然而，调节溶酶体适应的机制在很大程度上尚不清楚。在这里，我们发现转录因子EB（TFEB）是溶酶体生物发生的主要调节因子，与溶酶体膜上的主要生长调节因子mTOR复合物1（mTORC1）共定位。当营养物质存在时，mTORC1对TFEB的磷酸化会抑制TFEB活性。相反，mTORC1的药物抑制，以及饥饿和溶酶体破坏，通过促进其核转位激活TFEB。此外，TFEB-/-细胞中溶酶体和自噬基因对溶酶体功能障碍或mTORC1药物抑制的转录反应受到抑制。有趣的是，Rag GTPase复合物感测溶酶体氨基酸并激活mTORC1，对于调节饥饿和应激诱导的TFEB核移位既必要又充分。这些数据表明，溶酶体通过涉及TFEB和mTOR的溶酶体-细胞核信号机制来感应其内容物并调节自身的生物发生。

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图1
图1
溶酶体应激诱导TFEB核易位。(A类)表达TFEB–3×FLAG的HEK-293T细胞的免疫荧光，经过指定的处理，并用FLAG抗体和溶酶体标记LAMP2染色。合并中的FLAG和LAMP2通道分别为绿色和红色。合并中包括DAPI（蓝色）。比例尺表示10μm。(B)用核TFEB–3×FLAG定量四种条件下的细胞数量(A类). 每个值表示三个独立字段的平均值±标准差N个=300. (C类)按指示处理的HEK-293T细胞的免疫荧光，并用抗内源性TFEB和溶酶体蛋白RagC的抗体染色（合并中分别为绿色和红色）。DAPI包含在合并中。比例尺代表10μm。(天)用二甲基亚砜、氯喹（CQ）或SalA处理表达TFEB–3×FLAG的HeLa细胞提取的蛋白质进行免疫印迹，进行核/细胞溶质分离，并用FLAG抗体进行印迹以检测TFEB。H3和微管蛋白分别用作核标记物和细胞溶质标记物。印迹是一式三份实验的代表。
图2
图2
mTORC1调节TFEB。(A类)溶酶体应激抑制mTOR信号传导。如图所示，对从HeLa细胞中分离的蛋白质提取物进行免疫印迹。用抗p-T202/Y204-ERK1/2、ERK1/2、p-T389-S6K和S6K抗体检测细胞膜，以测定ERK和mTORC1活性。(B)Torin 1诱导TFEB去磷酸化和核移位。从TFEB–3×FLAG HeLa细胞中分离的细胞溶质和核组分的FLAG免疫印迹在无氨基酸介质中饥饿，随后按指示刺激至少3小时。H3和微管蛋白抗体验证了正确的亚细胞分馏。(C类)ERK和mTOR抑制剂对TFEB核转位的影响。将TFEB–GFP HeLa细胞接种在96个平板中，培养12 h，然后用指定浓度的ERK抑制剂U0126或mTOR抑制剂雷帕霉素、Torin 1和Torin 2处理。37°C下培养3小时后，使用OPERA自动共焦显微镜（Perkin-Elmer）处理细胞并采集图像。比例尺代表30μm。(天)ERK和mTOR抑制剂对TFEB核转位影响的剂量-反应曲线。将TFEB–GFP HeLa细胞接种在384孔板中，培养12 h，并用10种不同浓度的ERK抑制剂U0126或mTOR抑制剂雷帕霉素、Torin 1和Torin 2处理，范围从2.54 nM到50μM。该图显示了每种化合物在不同浓度下的核移位百分比（以浓度的对数表示）。使用Prism软件计算每种化合物的EC50（详见材料和方法）。(E类)用二甲基亚砜或Torin 1处理的HEK-293T细胞的免疫荧光，并用抗内源性TFEB和溶酶体蛋白RagC的抗体染色（合并中分别为绿色和红色）。DAPI包含在合并中。比例尺代表10μM。(F类)Rag GTPase敲除诱导TFEB核移位。稳定表达TFEB–3×FLAG的HeLa细胞感染慢病毒，慢病毒编码靶向荧光素酶（对照）或RagC和RagD mRNA的短发夹（Sh-）RNA。在所有样本中，感染后96小时，细胞未经处理（N=正常培养基）、饥饿（S=饥饿培养基）或用Torin 1（T=Torin 2）处理4小时，然后进行核/细胞溶质分离。用FLAG抗体检测TFEB定位，而微管蛋白和H3分别用作细胞溶质和核部分的对照；S6K磷酸化水平用于测试RagC和RagD敲除效率。(G公司)mTORC2缺失不影响TFEB磷酸化。从Sin1−/−或对照胚胎（E14.5）分离的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）感染编码TFEB–3×FLAG的逆转录病毒；感染后48小时，用Torin 1（T）处理细胞4小时，进行核/细胞溶质分离，并对FLAG、tubulin和H3进行免疫印迹。(H（H）)TFEB与mTORC1的结合。对表达TFEB–3×FLAG的HEK-293T细胞进行裂解并进行FLAG免疫沉淀，然后对mTOR、mTORC1亚单位raptor和mTORC2成分rictor和Sin1进行免疫印迹。FLAG–Rap2A作为阴性对照。
图3
图3
mTORC1在丝氨酸142处磷酸化TFEB（S142）。(A类)Torin 1诱导S142去磷酸化。按照指示处理HeLa细胞，用TFEB p-S142磷酸抗体和抗FLAG抗体探测总提取物和核提取物。饥饿或Torin 1处理后TFEB S142磷酸化的消失与TFEB在核部分中的积累相关。(B)mTORC1型体外激酶分析。高纯度FLAG–S6K1、TFEB–3×FLAG或TFEBS142A系列–3×FLAG与不含激酶的放射性标记ATP、纯化的mTORC1或mTORC1+Torin 1孵育，并通过放射自显影分析。下面板显示底物的FLAG免疫印迹。(C类)TFEB蛋白结构与预测的mTORC1磷酸化位点及其在脊椎动物中的保守性的示意图。编号依据人类亚型1。(天)磷酸位点的序列保守性得分以及mTOR共有基序和TFEB磷酸位点周围序列之间的定量一致性。(E类)S142和S211规定了TFEB定位。表达丝氨酸-丙氨酸突变型TFEB–3×FLAG的HeLa细胞的FLAG免疫染色（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。值是包含至少50个转染细胞的五个字段的平均值。学生的t吨-测试（未配对）***P（P）<0.001. 比例尺代表30μm。
图4
图4
mTORC1结合并磷酸化溶酶体表面的TFEB。(A类)共表达TFEB–GFP和mRFP–Rab7的MEF细胞的旋转盘共焦图像（合并中分别为绿色和红色）。(B)年装箱区TFEB-和Rab7-阳性溶酶体的时间推移(A类). 时间间隔以秒为单位。(C类)表达TFEB–GFP的MEF细胞Torin 1治疗的时间推移分析。箭头表示添加Torin 1的时间。黄色箭头表示Torin 1诱导的TFEB–GFP溶酶体积累。时间间隔以分钟为单位。(天)二甲基亚砜处理后表达TFEB–3×FLAG的HEK-293T细胞的免疫荧光(顶部)或Torin1(底部)并用FLAG和mTOR抗体染色（合并处分别为绿色和红色；DAPI为蓝色）。(E类)对来自对照MEF（蓝色）或经Torin 1处理的MEF（红色）的TFEB–GFP阳性溶酶体进行FRAP分析。每个数据点代表五个独立点的平均值±标准差。(F类)对照处理MEF中TFEB–GFP阳性溶酶体光漂白和荧光恢复的时间进程(顶部)或用Torin 1处理的MEF(底部). 红色箭头表示光漂白时间。时间间隔以秒为单位。(G公司)Torin 1增加TFEB与mTORC1的结合。表达TFEB–3×FLAG以及HAGST-Rap2A或HAGST-Rags的HEK-293T细胞DN（公称直径）用载体或Torin1处理，裂解并进行FLAG免疫沉淀，然后进行mTOR和猛禽的免疫印迹。FLAG–Metap2作为阴性对照。(H（H）)表达TFEB–3×FLAG和Rap2A的HEK-293T细胞的免疫荧光(顶部)或是愤怒DN（公称直径）突变体(底部)用Torin 1处理，并用FLAG和LAMP2抗体染色（合并处分别为绿色和红色；DAPI为蓝色）。在所有图像中，比例尺代表10μm。
图5
图5
Rag GTPases控制TFEB亚细胞定位。(A类——C类)表达TFEB–3×FLAG以及对照GTPase或指示Rag突变体的HEK-293T细胞的免疫荧光。细胞被剥夺了氨基酸(顶部)或者被剥夺然后被刺激(底部)用于指示的时间，并为FLAG和mTOR染色（合并中分别为绿色和红色；DAPI为蓝色）。(天)量化每种情况下带有核TFEB的细胞数量(A类——C类). (E类,F类)表达TFEB–3×FLAG和Rap2A的HEK-293T细胞的免疫荧光(E类)或碎布加利福尼亚州突变体(F类)进行指示的治疗，并用FLAG和mTOR抗体染色（合并处分别为绿色和红色；DAPI为蓝色）。(G公司)DMSO和CQ处理的场中带有核TFEB的细胞数量的量化(E类)和(F类). 在所有字段中，比例尺代表10μm。在所有直方图中，每个值代表三个独立字段的平均值±标准差N个=300.
图6
图6
溶酶体通过TFEB调节基因表达。(A类)氯喹治疗抑制原代肝细胞中的mTORC1活性。2个月大的原代肝细胞分离Tcfeb公司flox/flox（控制）和Tcfeb公司flox/flox；Alb-Cre公司(Tcfeb公司−/−）小鼠未经治疗，或使用Torin 1、U0126或氯喹治疗过夜。随后，对细胞进行裂解，并用所示抗体对蛋白提取物进行免疫印迹。(B、 C类)TFEB介导对氯喹和Torin 1的转录反应。对照（flox/flox）和Tcfeb公司−/−小鼠。用氯喹（左）或Torin 1（右）处理细胞。图表显示了处理后的样品与相应的未处理样品相比表达的相对增加。数值代表三种独立肝细胞制剂（三只小鼠/基因型）的平均值±标准差。学生的t吨-测试（双尾）*P（P）-值⩽0.05。
图7
图7
TFEB和mTOR的溶酶体传感和溶酶体-细胞核信号传递模型。(A类) (左侧)在充分营养和没有溶酶体应激的情况下，由v-ATP酶、Ragulator和Rag GTPases形成的复合物处于活性状态，并将mTORC1招募到溶酶体表面，在那里mTORCl被激活。在溶酶体，mTORC1结合并磷酸化TFEB，TFEB在细胞质和溶酶体表面之间循环。mTORC1的磷酸化作用维持了细胞质中的TFEB并阻止其转移到细胞核。(赖特)饥饿、v-ATP酶抑制或溶酶体应激使Rags关闭，导致mTORC1从溶酶体分离并失活。TFEB不能再被磷酸化并转移到细胞核，在那里它激活基因表达程序，从而促进溶酶体功能和自噬。(B)健康细胞和饥饿/应激细胞的侧面图，显示了mTORC1和TFEB在溶酶体、细胞质和细胞核中的各自分布。
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参考文献

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