Akt inhibitors MK-2206 and nelfinavir overcome mTOR inhibitor resistance in diffuse large B-cell lymphoma

doi:10.1158/1078-0432.CCR-11-1407

.2012年5月1日；18(9):2534-44.

doi:10.1158/1078-0432.CCR-11-1407。 Epub 2012年2月14日。

Akt抑制剂MK-2206和奈非那韦克服弥漫性大B细胞淋巴瘤对mTOR抑制剂的耐药性

亚当·彼得里奇¹, 维奥莱塔·莱斯琴科, 裴玉国, 冰霞, Venu K Thirukonda公司, 乌兰巴托, 沙尼莎·戈登, 梅丽莎·法扎里, B希尔达·叶, 约瑟夫·斯巴拉诺, 萨米尔·帕雷克

附属公司

PMID： 22338016
预防性维修识别码：项目经理3889476
内政部： 10.1158/1078-0432.CCR-11-1407

Akt抑制剂MK-2206和奈非那韦克服弥漫性大B细胞淋巴瘤对mTOR抑制剂的耐药性

亚当·彼得里奇等。临床癌症研究. 2012.

.2012年5月1日；18(9):2534-44.

doi:10.1158/1078-0432.CCR-11-1407。 Epub 2012年2月14日。

作者

亚当·彼得里奇¹, 维奥莱塔·莱斯琴科, 裴玉国, 冰霞, 维努·K·蒂鲁孔达, 内塔·乌拉汉南, 沙尼莎·戈登, 梅丽莎·法扎里, B希尔达·叶, 约瑟夫·斯巴拉诺, 萨米尔·帕雷克

附属

¹Montefiore医疗中心，美国纽约州布朗克斯。

PMID： 22338016
预防性维修识别码：项目经理3889476
内政部： 10.1158/1078-0432.CCR-11-1407

摘要

目的：mTOR通路在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中被组成性激活。mTOR抑制剂在DLBCL中有活性，尽管反应率仍然很低。我们评估了对mTOR抑制剂雷帕霉素具有不同耐药性的DLBCL细胞系：（i）确定与雷帕霉素耐药性相关的基因表达谱（GEP），（ii）了解雷帕霉素耐药的机制，以及（iii）确定可能与mTOR抑制剂协同作用的化合物。

实验设计：我们试图通过对8个DLBCL细胞系进行雷帕霉素反应分层来确定mTOR抑制剂耐药性的GEP。然后，利用通路分析和连接图谱，我们寻找可能解释这种耐药性的靶点和可能克服它的化合物。然后，我们评估了两种化合物，从而确定了它们与DLBCL中雷帕霉素协同作用的潜力，并用标准免疫分析法确认了活性机制。

结果：我们鉴定了一种能够可靠区分雷帕霉素抗性和雷帕霉素敏感性DLBCL细胞系的GEP。通路分析确定Akt是差异表达基因网络的核心。连接性映射确定靶向Akt的化合物极有可能逆转与mTOR抑制剂耐药性相关的GEP。根据Akt抑制特性选择的奈非那韦和MK-2206与雷帕霉素联合使用，可协同抑制DLBCL细胞系中的细胞活力，并有效抑制Akt的磷酸化和活化mTOR的下游靶点。

结论：GEP确定对mTOR抑制剂治疗耐药的DLBCL亚群。mTOR和Akt联合靶向抑制Akt/mTOR通路关键成分的激活，并导致协同细胞毒性。这些发现很容易适用于临床试验。

PubMed免责声明

数字

**图1。基因表达谱鉴定一种能够预测DLBCL细胞系中雷帕霉素耐药性的特征**
答：10⁶每毫升DLBCL细胞用5-200nM雷帕霉素处理48小时。与剂量/反应曲线相对应的DLBCL细胞系按耐药程度标记在图的右侧。这些细胞系构成了我们的模式识别算法的“训练”集。治疗后的细胞存活率通过荧光分析法评估。X轴表示雷帕霉素浓度；Y轴，与对照组相比活细胞的百分比。每个点的值表示八次测量得出的平均+/-标准偏差（SD）。对每个细胞系进行了三次测试，并显示了具有代表性的结果。C类_最大值从I期试验（15）中得出的癌症患者中，用灰色垂直线表示。B.使用常规和改良T检验（见材料和方法），在雷帕霉素敏感和雷帕霉素耐药细胞系之间鉴定出这些基因差异表达的特征，显著性p<0.03。这个签名在这里由GenePattern服务器生成的监督集群热图表示。C.使用GenePattern Server上的SVM类预测算法分析图1B中显示的签名，以预测六个额外细胞系（组成我们的验证集）的响应模式。这些细胞系的预测和观察到的反应模式，以及相应的IC₅₀水平。

**图2。DLBCL细胞系雷帕霉素反应的基因表达谱确定Akt的中心作用**
A-B.使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）Server上的Core Analysis功能分析图1B中显示的签名。通过此分析丰富的顶层网络图如所示（A）。通过相同特征的IPA岩芯分析确定的最丰富的生物功能如图B所示，Fisher的精确测试p值如图所示。C.使用基因名Akt1和疾病类型过滤器“淋巴瘤”查询Oncomine数据库。这提供了健康B细胞（C：成中心细胞；GCB：生发中心B淋巴细胞；n=6）、活化B细胞样DLBCL（ABC-DLBCL；n=26）和GCB-like DLBCL的原发（人类）样本中Akt基因表达水平组织样本。这些数据在这里表示为每组样本的瀑布图，其中Y轴表示对数-2中位居中的比率，每个样本按该比率值的顺序显示。D.通过Western blotting分析总Akt和肌动蛋白的蛋白质水平。将总Akt水平与肌动蛋白（X轴；如“方法和材料”中所述，使用ImageJ测量）进行量化，然后根据IC绘制₅₀（Y轴）。

**图3。连接性映射可以识别以PI3K/Akt通路为靶点的化合物，这些化合物在临床相关剂量下与雷帕霉素协同作用**
A.差异表达基因的签名被提交到连接图（Cmap）服务器进行分析。这里显示了所选化合物的等级、名称和Cmap分数，根据对该特征的分析，每个化合物都在前2%的干扰剂范围内。B-C.10号机组⁶用雷帕霉素、Akt抑制剂（Nelfinavir或MK-2206）以及雷帕霉素和Akt抑制物的组合处理两个雷帕霉素敏感细胞系（SUDHL-6和WSU-NHL）和两个雷帕霉素耐药细胞系（SUDHL-4和OCI-Ly19）DLBCL细胞的每毫升细胞48小时。通过荧光法重苏林还原试验评估生存能力。每个实验都进行了八次，重复两次，并显示了具有代表性的结果。图中显示了用雷帕霉素和奈尔芬诺（Nelf）（B）以及雷帕霉素与MK-2206（C）处理的雷帕霉素耐药细胞系SUDHL-4的存活模式。Y轴表示活细胞的百分比。D.根据Calcusyn软件采用的Chou-Talalay方程计算上述四种细胞系（SUDHL-6、WSU-NHL、SUDHL-4和OCI-Ly19）的组合指数（CI）值。此处显示的是SUDHL-4细胞系中观察到的CI值。其他三种细胞系也取得了类似的结果，表明存在协同作用。电子表格10⁶相同的四个DLBCL细胞系（SUDHL-6、WSU-NHL、SUDHL-4和OCI-Ly19）的细胞/ml用雷帕霉素和奈尔芬尼（Nelf）（E）、雷帕霉素（Rapamycin）和MK-2206（F）处理12小时，然后用碘化丙啶染色后进行流式细胞仪分析。每个实验在独立的条件下重复两次，并显示具有代表性的结果。每个治疗组中处于S期的细胞比例显示为细胞周期进展的标志。Y轴表示S相细胞的百分比。G.雷帕霉素耐药细胞系（SUDHL-4和OCI-Ly19）在25 nM下用雷帕霉素处理6小时，在300 nM下使用MK-2206，然后用Western blot技术制备细胞裂解物并进行分析。重复每个实验，并提供具有代表性的结果。这里显示的是SUDHL-4细胞系中裂解半胱天冬酶3（左）和裂解PARP（右）的分析结果。

**图4。雷帕霉素治疗可诱导Akt活化，Akt抑制剂可消除雷帕霉素诱导的Akt激活**
A至B。10⁶相同的四个DLBCL细胞系（SUDHL-6、WSU-NHL、SUDHL-4和OCI-Ly19）的每毫升细胞用雷帕霉素、Akt抑制剂（奈尔芬那韦或MK-2206）以及雷帕霉素和Akt抑制剂联合治疗3小时和6小时。在用雷帕霉素和奈非那韦（A）处理的SUDHL-6（雷帕霉素敏感）细胞和用雷帕辛和MK-2206（B）处理的SU-DHL 4（雷帕辛耐药）细胞中，对磷酸化Akt（占总Akt的比例）进行了基于流式细胞仪的多重蛋白分析。每个实验在独立条件下进行，一式三份，显示平均值和SD。星号表示具有统计学意义的差异（t检验p值<0.05）。C-D。用雷帕霉素（25 nM）、奈非那韦（15 uM）和联合用药治疗一个雷帕霉素耐药细胞系（SUDHL-4）和一个雷巴霉素敏感细胞系（SUDHL-6）6小时；或雷帕霉素（25 nM）、MK-2206（300 nM）及联合用药；然后制备细胞裂解物并用Western blot技术进行分析。重复每个实验，并提供具有代表性的结果。这里显示的是用雷帕霉素（5nM）和MK-2206（100nM）处理6小时的SUDHL-6细胞（C）和SUDHL-4细胞（D）中磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化-S-6核糖体蛋白（p-S6RP）和磷酸化4-EBP-1（p-4-EBP-1）的分析结果。

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