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.2012年4月10日；109（15）：E869-78。
doi:10.1073/pnas.1115623109。 Epub 2012年2月6日。

IRE1结合小分子选择性抑制非常规mRNA剪接的分子基础

本尼迪克特·C·S·克罗斯 1, 彼得·邦德, 帕维尔·G·萨多夫斯基, 巴巴尔·坎特·贾, 雅罗斯拉夫·扎克, 乔纳森·古德曼, 罗伯特·H·西尔弗曼, 托马斯·诺伊伯特, 伊恩·巴克森代尔, 大卫·罗恩, 希瑟·P·哈丁
附属公司

IRE1结合小分子选择性抑制非常规mRNA剪接的分子基础

本尼迪克特·C·S·克罗斯等。 美国国家科学院程序. .

摘要

IRE1将内质网展开蛋白负载与RNA裂解事件耦合，最终导致Xbp1 mRNA的序列特异性剪接和不同膜结合mRNA的调节降解。我们报道了一种小分子抑制剂的鉴定，该抑制剂通过在IRE1内切酶结构域中与赖氨酸907形成异常稳定的希夫碱来实现其选择性，这可以通过酶抑制剂复合物中亚胺键的溶剂不可接近性来解释。抑制剂（缩写为4μ8C）阻止底物进入IRE1的活性位点，并选择性地使Xbp1剪接和IRE1介导的mRNA降解失活。令人惊讶的是，抑制IRE1内切酶活性并不会使细胞对急性内质网应激的后果敏感，反而会干扰分泌能力的扩大。因此，选择性抑制剂可以利用IRE1内切酶活性位点中独特残基的化学反应性和立体结构来干扰病理环境中的蛋白质分泌。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
基于香豆素的IRE1抑制。(A类)CB5305630[7-羟基-4-甲基-8-（（吡啶-2-亚氨基）甲基）-2H-丙酮]的结构，这是在238287个化合物的筛选中确定的最有效的IRE1抑制剂。注意伞形酮和吡啶之间的亚胺键。(B类)在指示的CB5305630浓度下，IRE1的RNase初始速度（Vi）作为RNA底物浓度的函数图（平均值±SD，n个 = 2).K（K）米RNA底物约为37 nM，不受抑制剂的影响，而Vmax以浓度依赖的方式被抑制K（K）我约60 nM。(C类)CB5305630对IRE1核糖核酸酶活性的浓度依赖性抑制图（平均值±SD，n个 = 4). (D类)自动射线照片32在不存在或存在指示浓度的CB5305630的情况下通过IRE1切割后的P-标记的RNA底物。
图2。
图2。
在4μ8C和IRE1之间形成稳定的希夫碱。(A类)4μ8C希夫碱形成4μ8C-赖氨酰亚胺（反应1）的预测反应方案，可通过硼氢化物（NaBH）还原为稳定的赖氨酰胺4，反应2）。反应3描述了4μ8C对8-羟甲基的还原失活。(B类)IRE1与4μ8C的孵育时间与表观IC的关系图50体外核糖核酸酶分析（平均值±扫描电镜，n个 = 2). (C类)IRE1的体外核糖核酸酶活性在与之前用硼氢化物（NaBH）降低的4μ8C和4μ8C孵育后4; 平均值±SEM，n个 = 2). （D） 从装有IRE1或IRE1和200μM 4μ8C的尺寸排除色谱柱中洗脱的材料的吸光度迹线。注意，在4μ8C处理的样品中，在350 nm处出现了一个新的吸收峰，与IRE1共存。(E类)负载IRE1的SDS-PAGE的荧光显微照片（激发340 nm，发射450 nm），在暴露120μM 4μ8C的指示时间后，使用或不使用硼氢化物进行后续还原。通道6中的样品与之前用硼氢化物还原灭活的4μ8C反应。
图3。
图3。
IRE1中的两种关键赖氨酸被4μ8C选择性靶向。(A类)从C18反相HPLC洗脱的肽的吸收痕迹。柱上装有表达IRE1的杆状病毒的胰蛋白酶消化物，该病毒曾接触或未接触120μm 4μ8C，然后用硼氢化物还原。注意暴露于4μ8C的样品中在320 nm处出现的两个峰（标记为“A”和“B”）。(B类)在峰“A”和“B”中恢复的材料的MALDI-TOF光谱A类以上。峰值，对应于预测的单电荷4μ8C修饰肽NH的质量2-Asn-Lys-Lys-COOH（上标记为NKK+4μ8C）和NH2-挑选出Asp-Val-Ala-Val-Lys-Arg-COOH（在较低记录道中标记为DVAVKR+4μ8C），以引起注意。未经修饰的DVAVKR肽也可以检测到，这可能是由于修饰的源内损失所致。(C类)在320 nm处的肽吸收痕迹A类来自免疫纯化的FLAG-标记IRE1样品重量未经修改的（−4μ8C，面板我)或IRE1重量，爱尔兰共和国K907A型和IRE1K599A公司用120μm 4μ8C（面板ii（ii）–iv（四）). 注意IRE1中没有峰值“A”K907A型样品和IRE1中无峰值“B”K599A公司样品。(D类)K的位置599和K907人体IRE1α（来自PDB ID代码3P23 A链）。(E类) (上部)IRE1的SDS-PAGE在与γ32P-ATP在浓度从32μM降至4μ8C的两倍稀释液中的情况下。(下部)相同凝胶的考马斯亮蓝（CBB）染色。(F类)从表达IRE1的野生型杆状病毒或在不含4μ8C的情况下纯化的免疫纯化Flag-IRE1衍生的肽的吸收痕迹（320 nm）(ii（ii）)或EDTA(三). (G公司)如中所示C类和F类.如有指示，核苷酸结合袖珍配体ADP(ii（ii）)和星形孢菌素(三)在添加4μ8C之前进行预培养。
图4。
图4。
4μ8C与IRE1赖氨酸907的稳定结合。(A类)从C18反相HPLC洗脱的肽的吸收痕迹（如图3所示）。如有指示，允许最近描述的IRE1抑制剂MK0186893（31）和STF083010（32）与4μ8C竞争IRE1结合。(B类)根据载脂蛋白状态的分子动力学模拟，在指示的时间点拍摄IRE1 RNase结构域的快照，并将4μ8C连接到K907通过亚胺。注意在4μ8C存在下，载脂蛋白状态和稳定构象的相对灵活性。突出显示的残留物为Y892，F889，N个906，K907、和H910对PDB ID代码为3P23的两种原生质体进行了五次不同启动速度的重复模拟，并得出了可比较的结果。(C类)预测IRE1中赖氨酸残基在载脂蛋白状态下的溶剂可及性（SAS）和与水的氢键结合（基于PDB ID代码3P23），并存在MD模拟得出的指示结合配体。
图5。
图5。
通过4μ8C在体内选择性靶向IRE1 RNase。(A类)荧光染色琼脂糖凝胶的RT-PCR分析新业务流程1将MEF细胞的mRNA与浓度增加的4μ8C和内质网应激致敏剂突尼斯霉素（Tm 2.5μg/mL）或载体对照物同时处理6小时。拼接（Xbp1）的迁移S公司)和未拼接（Xbp1U型)表格已注明。(B类)通过SDS-PAGE或PhosTag™-PAGE分析，并用IRE1的磷酸特异性抗血清进行探针检测，对同时用thapsigargin（Tg 0.5μM）和4μ8C（32μM）处理的MEF细胞或载体对照进行指定时间的内源性IRE1α免疫纯化的免疫印迹S724号或总IRE1，如图所示。下面板是内源性（小鼠）的RT-PCR新业务流程1来自相同细胞的mRNA。(C类)载体对照（深灰色条）处理6小时后MEF细胞中mRNA表达的定量PCR（qPCR）分析；衣霉素（2.5μg/mL）单独使用（浅灰色）或与浓度增加两倍的4μ8C（黑条）共同处理，从0.125μM增加到64μM（平均值±SEM，n个 = 2). (D类)膜霉素诱导的图谱新业务流程1拼接和Erdj4号机组与指定浓度的4μ8C共同作用6小时后，细胞中的表达。注意IC中的相似性50对于4μ8C活性的两种体内读数（平均值±SEM，n个=2用于Erdj4号机组).
图6。
图6。
4μ8C抑制RIDD。(A类)体外转录的自体放射自显影32P标记鼠标新业务流程1或胰岛素2(检查2)在不存在或存在4μ8C（10μM）的情况下，与指示浓度的IRE1孵育后，通过电泳分离mRNA。(B类)在存在2–5A辅因子和存在或不存在指示浓度的4μ8C或舒尼替尼（45）的情况下，通过FRET分析测量RNase L活性。(C类)在32μM 4μ8C（平均值±SEM，n个 = 2). (D类)RIDD靶基因mRNA水平图斯卡拉3在同时暴露于指示浓度的4μ8C（平均值±SEM，n个=2）持续6小时。(E类)半透性野生型和Perk细胞膜组分中嘌呤霉素化蛋白的免疫印迹-/-突变MEF在32μM 4μ8C的存在和不存在下暴露于毒霉素（500 nM）或衣霉素（2.5μg/mL）达指定时间。整合在每条车道表面上的信号强度绘制在免疫印迹图像下。
图7。
图7。
4μ8C可选择性地抑制分泌能力的扩张。(A类)暴露于升高（2倍）浓度的4μ8C（从1μM到128μM）或thapsigargin（从16到1024 nM；平均值±SEM，n个 = 3). (B类)暴露于4μ8C（从1到128μM；平均值±SEM，n个 = 3). (C类)暴露于不断升高（2倍）的衣霉素浓度（从16到2048 ng/mL）下24小时，以及在没有或存在4μ8C（32μM；平均值±SEM，n个 = 3). (D类)多发性骨髓瘤MM.1R细胞在没有或存在硼替佐米（Bz，6 nM）的情况下暴露于指示浓度的4μ8C下的时间依赖性生长，通过WST1分析进行评估（平均值±SEM，n个 = 3). (E类)在没有或存在4μ8C（32μM）的情况下，用地塞米松（100 nM，一种分化为分泌状态的诱导剂）处理48小时的AR42J细胞的典型电子显微照片(F类)定量显示按中处理的样品中ER横截面积与胞质溶胶横截面积（AU）的比率E类（平均值±SEM，n个 = 5; * 表示第页T检验<0.05）。(G公司)在含有或不含有4μ8C（32μM；平均值±SEM，n个 = 3). (H（H）)淀粉酶分泌G公司地塞米松（DEX，100 nM），浓度范围为4μ8C（平均值±SEM，n个 = 3).
图P1。
图P1。
靶向抑制IRE1。经高通量筛选鉴定的8-甲酰基-7-羟基-4-甲基香豆素（缩写为4μ8C，见插图），在体外FRET去抑制试验（见图表）和培养细胞中均能高选择性抑制哺乳动物IRE1的内切酶活性。该化合物通过形成异常稳定的希夫碱与IRE1内切酶活性位点中的关键赖氨酸结合。IRE1 K型907-4μ8C修饰通过与F形成堆叠相互作用限制内切酶位点的灵活性889并在必需的催化残基之间插入，使酶失活。结构显示人类IRE1原聚体（蛋白质数据库ID代码3P23，左侧)和细节(右下角，残基870到939）表示在K处计算停靠4μ8C（绿色）907，残基为F889，Y892，N个906，K907、和H910突出显示。
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