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.2012年4月；8(4):545-58.
doi:10.4161/auto.19012。 Epub 2012年4月1日。

自噬：一种防止氧化应激期间原代人肝细胞凋亡的细胞保护机制

瑞奇·H·博加尔 1, 克里斯托弗·J·韦斯顿, 斯图亚特·M·柯比什利, 大卫·H·亚当斯, 西蒙·艾福德
附属公司

自噬：一种在氧化应激过程中防止原代人肝细胞凋亡的细胞保护机制

瑞奇·H·博加尔等。 自噬. 2012年4月.

摘要

自噬在人类肝细胞对氧化应激反应中的作用尚不清楚。了解这一过程可能对理解基本肝上皮细胞生物学和肝脏疾病期间肝细胞的反应具有重要意义。为了解决这个问题，我们从人类肝组织中分离出原代肝细胞，并将其在体外暴露于缺氧和低氧再氧化（H-R）。我们发现氧化应激以活性氧物种（ROS）和III类PtdIns3K依赖方式增加肝细胞自噬。具体而言，线粒体ROS和NADPH氧化酶被发现是自噬的关键调节器。自噬涉及缺氧和H-R期间BECN1、LC3A、Atg7、Atg5和Atg12的上调。自噬发生在肝细胞线粒体内，自噬抑制导致线粒体膜电位降低和细胞死亡。自噬反应主要在大的眼球周（PV）肝细胞亚群中观察到。使用3-甲基腺嘌呤抑制自噬可增加H-R期间的凋亡。这些发现首次表明，在氧化应激期间，自噬是人类原代肝细胞的一种细胞生存机制。

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数字

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图1。在缺氧和H-R期间，原代人肝细胞中的细胞内ROS积累是线粒体依赖性的。（A）展示了具有代表性的流式细胞术图，以说明通过DCF染色评估的常氧（蓝色）、缺氧（阴影红色）和H-R（实心灰色）对人肝细胞ROS产生的影响。流式细胞仪图的左侧显示了H-R期间人类原代肝细胞的典型FS与SS图。已知人类肝细胞的大小差异很大，因此需要一个大的门来包含分析中的所有细胞。有关选通程序和协议的更多详细信息，请参阅“方法和材料”部分。在常氧和缺氧期间，获得了类似的FS与SS曲线（数据未显示）。流式细胞仪图上感兴趣的区域用垂直椭圆标记。每个椭圆左侧的区域代表细胞碎片。由于人类肝细胞的大小差异很大，细胞碎片包括在图中，因此要在分析中包括所有活的人类肝细胞，流式细胞仪上需要一个大的门，这必然包括细胞碎片。代表性图是从良性肝病中分离出的正常人肝细胞（n=7）。（B） 显示了复合条形图，以说明缺氧和H-R对使用DCF和Mitosox从良性肝病中分离的人类肝细胞ROS生成的影响。DCF是人类肝细胞中过氧化氢生成的测量值。过氧化氢是肝细胞内产生的主要活性氧。线粒体检测线粒体特异性产生的活性氧。在这些实验中，从相同的肝楔中分离出人类肝细胞，然后在我们的体外缺氧和H-R模型中同时使用，以测定正常氧、缺氧和H-R.期间的DCF和Mitosox染色。数据表示为平均荧光强度（MFI），其值来自（A）中所示的门。用于这些实验的人类肝细胞是从良性肝病中分离出来的（n=3-4）。（相对于常氧，**p<0.05；相对于低氧，**p<0.05；对于常氧，****p<0.01，Mann-Whitney试验）。
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图2。细胞内ROS积累与人类肝细胞缺氧和H-R期间自噬增加有关。该图展示了一个代表性的流式细胞术图，以说明常氧（蓝色）、缺氧（阴影红色）和H-R（实心灰色）对从良性肝病中分离的人类肝细胞内自噬的影响。同样，流式细胞仪图中感兴趣的区域用垂直椭圆标记。图1A中所示的图中，对原代人肝细胞应用了相同的门。条形图显示了五个单独实验的汇总数据，说明了缺氧和H-R对人类肝细胞自噬的影响（n=5）。数据表示为相对于基底细胞的增加，其中基底细胞是指正常氧环境下的自噬水平。数据表示为平均值±SE（*p<0.05，相对于基本的Mann-Whitney检验）。
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图3。不同肝病分离的人肝细胞自噬诱导水平的差异。该图显示了从不同肝病中分离出的人类肝细胞的自噬水平。这些肝细胞的FS和SS图与图1A所示相同（n=3-6）。
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图4。在H-R期间，线粒体和NADPH氧化酶介导人类肝细胞的自噬。该图显示了典型的流式细胞术图，以说明NAC、鱼藤酮和DPI对H-R期间人类肝细胞自噬的影响。H-R期间MDC细胞的染色显示为蓝色，NAC、，鱼藤酮和DPI显示为纯灰色。在常氧和缺氧期间也获得了类似的数据（数据未显示）。同样，流式细胞仪图中的感兴趣区域用垂直椭圆标记。图1A中所示的图中，对原代人肝细胞应用了相同的门。条形图显示了三个单独实验的汇总数据，说明了NAC、鱼藤酮和DPI在H-R期间对人肝细胞自噬的影响。在常氧和缺氧期间获得了类似的数据（数据未显示）。数据表示为相对于H-R的抑制百分比，其中H-R期间的自噬水平代表100%。数据表示为平均值±SE（*p<0.05，相对于单纯H-R，**p<0.01，相对于单纯的H-R，Mann-Whitney检验）。用于这些实验的人类肝细胞是从良性肝病中分离出来的（n=3-5）。
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图5。抑制自噬可增加H-R期间人类肝细胞的凋亡。该图显示了典型的流式细胞术图，以证明3-MA预处理原代人肝细胞的效果以及H-R期间对凋亡和自噬的影响。H-R期间的细胞凋亡和自噬水平以蓝色显示，3-MA预处理的效果以实心灰色显示。感兴趣的区域用垂直椭圆标记。与图1A所示相同的门已应用于这些图的原代人类肝细胞。每个流式细胞仪图右侧的条形图显示了三个独立实验的汇总数据。数据表示为相对于基础值的增加或减少，其中基础值是指H-R期间ROS生成、凋亡、坏死或自噬的水平。数据表示为平均值±SE（*p<0.05，相对于基础值，Mann-Whitney检验）。用于这些实验的人类肝细胞是从良性肝病中分离出来的（n=3）。
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图6。抑制自噬可减少H-R期间人类肝细胞中ROS的生成，但不影响坏死。该图显示了代表性的流式细胞仪图，以证明3-MA预处理原代人肝细胞的效果以及在H-R期间对细胞内ROS生成和坏死的影响。H-R过程中细胞内ROS产生和坏死的水平显示为蓝色，3-MA预处理的效果显示为灰色。感兴趣的区域用垂直椭圆标记。图1A中所示的图中，对原代人肝细胞应用了相同的门。每个流式细胞仪图右侧的条形图显示了三个独立实验的汇总数据。数据表示为相对于基础值的增加或减少，其中基础值是指H-R期间ROS生成、凋亡、坏死或自噬的水平。数据表示为平均值±SE（*p<0.05，相对于基础值，Mann-Whitney检验）。用于这些实验的人类肝细胞是从良性肝病中分离出来的（n=3）。
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图7。BECN1、LC3A、Atg 5、Atg 7和Atg 12由缺氧和H-R在人类肝细胞中诱导。该图说明了在缺氧和H-R期间参与调节自噬的各种Atg蛋白的诱导。还显示了PtdIns3K抑制剂3-MA对缺氧和H-R期间Atg蛋白诱导的影响。所有蛋白质印迹至少进行了三次，呈现的印迹代表了所有样本（n=3）。
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图8。在H-R期间，抑制自噬会增加人类肝细胞的凋亡。该图显示了正常氧、缺氧和H-R期间存在和不存在3-MA时人类原代肝细胞的典型光学显微镜图像。在常氧状态下，人类肝细胞是典型的长方体形态，许多细胞具有典型的双核外观。在缺氧和H-R期间，细胞失去了这种外观，许多细胞在汇合的单层细胞中出现小的萎缩，表明有凋亡小体。在常氧、缺氧或H-R条件下进行3-MA预处理后，更多的细胞出现阶段性变亮、变小和萎缩。此外，肝细胞单层受到破坏。这些光学显微镜图像是在缺氧和h-R中孵育24小时后拍摄的，无论是否存在3-MA。（放大倍率x20）。
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图9。在缺氧和H-R期间，自噬主要在人类肝细胞的线粒体中进行。该图显示了缺氧和H-R对人类肝细胞线粒体膜电位和MDC染色的影响。用特异性染料JC-1测定线粒体膜电位。当线粒体膜电位正常时，JC-1呈红色，但一旦膜电位降低或消失，染料变绿。在DAPI通道中检测到MDC染色，呈蓝色。复合叠加图像显示在图的底部。此外，未染色的图像还带有染色图像，以突出免疫荧光的细胞位置。在常氧状态下，正如预期的那样，线粒体膜电位正常，没有发现自噬现象。在缺氧和H-R期间，红色JC-1染色逐渐消失，绿色JC-1染色增加，表明线粒体电位丧失和细胞死亡开始。此外，在缺氧和H-R期间，人肝细胞中MDC染色增加。此外，MDC染色和绿色JC-1染色在缺氧和-HR期间共同定位于人肝细胞。
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图10。缺氧和H-R期间大人类肝细胞的自噬反应。顶部面板显示了一个典型的流式细胞术图，以说明PV/大人体肝细胞在常氧（蓝色）、缺氧（阴影红色）和H-R（实心灰色）期间的MDC染色水平。流式细胞仪图左侧的图表示典型的FS与SS图，类似于图1A所示。FS与SS图来自H-R样本，但在常氧和缺氧期间获得了类似的图（数据未显示）。FS与SS图显示了用于人类肝细胞分析PV/大型人类肝细胞的门控方案。每个流式细胞仪图的感兴趣区域用一个垂直椭圆标记。下图显示了3-MA预处理对H-R期间PV/大的人肝细胞自噬和凋亡的影响。单独的H-R的影响显示为蓝色，3-MA预处理的影响显示为灰色。条形图显示了四个独立实验的合成数据。数据表示为平均值±SE（*p<0.05，相对于基本的Mann-Whitney检验）。
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图11。低氧和H-R期间人类小肝细胞的自噬反应。该图显示了典型的流式细胞术图，以说明正常氧（蓝色）、低氧（阴影红色）和H-R（实心灰色）期间PP/人类小肝细胞核的MDC染色水平。FS与SS图来自H-R样本，但在常氧和缺氧期间获得了类似的图（数据未显示）。FS与SS图显示了用于人类肝细胞分析PP/小型人类肝细胞的门控方案。流式细胞仪图上感兴趣的区域用垂直椭圆标记。底部面板显示了3-MA预处理对PP/人小肝细胞在H-R期间自噬和凋亡的影响。H-R单独的影响以蓝色显示，3-MA预治疗的影响以灰色显示。条形图显示了四个独立实验的合成数据。数据表示为平均值±SE（*p<0.05，相对于基本的Mann-Whitney检验）。
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图12。低氧和H-R期间人类肝细胞自噬的拟议调节。低氧和-HR导致人类肝细胞主要以线粒体依赖的方式产生ROS。正如我们之前的工作所证明的那样，缺氧和H-R期间ROS增加可导致细胞凋亡和坏死2（黑色箭头）。然而，增加的活性氧还可以激活自噬，而活性氧抑制剂NAC、鱼藤酮或DPI可以抑制自噬从而降低凋亡、坏死和自噬水平。正如Kohli等人在肝细胞中所证明的那样，ROS可以激活PI3-K34，这是自噬体组装的重要第一步。一旦被激活，包括BECN1、LC3A、Atg5、Atg7和Atg12在内的许多Atg蛋白参与自噬体的成熟。自噬过程似乎主要是在缺氧和H-R期间清除人类肝细胞中功能失调的线粒体，而H-R反过来又有助于细胞存活（绿色箭头）。用3-MA抑制PtdIns3K可确保自噬体不会发育，并且在缺氧和H-R期间不会在人类肝细胞中诱导Atg蛋白（红色箭头）。因此，人类肝细胞不能进行自噬，因此线粒体失去膜电位，以凋亡的形式导致细胞死亡。
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    1. Bhogal RH、Curbishley SM、Weston CJ、Adams DH、Afford SC。活性氧物种在缺氧/复氧期间介导人类肝细胞损伤。肝脏转运。2010;16:1303–13. doi:10.1002/lt.22157。-内政部-公共医学
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    1. Mortimore GE，PösöAR，Lardeux BR。肝脏中蛋白质降解的机制和调节。糖尿病Metab Rev.1989；5:49–70. doi:10.1002/dmr.5610050105。-内政部-公共医学
    1. Lu Z、Dono K、Gotoh K、Shibata M、Koike M、Marubashi S等。大鼠肝细胞移植后长期低温保存后的退化过程中自噬的参与。Arch Histol细胞。2005;68:71–80. doi:10.1679/aohc.68.71。-内政部-公共医学

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