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.2011;6（12）：e29498。
doi:10.1371/journal.pone.0029498。 Epub 2011年12月29日。

应激诱导的C/EBP同源蛋白（CHOP）抑制MyoD转录以延迟成肌细胞分化

乔尔·奥尔特 1, 孟加拉埃亚尔语
附属公司

应激诱导的C/EBP同源蛋白（CHOP）抑制MyoD转录以延迟成肌细胞分化

乔尔·奥尔特等。 公共科学图书馆一号. 2011.

摘要

当小鼠成肌细胞或卫星细胞在培养中分化时，肌源性调节因子MyoD的表达在不分化的细胞亚群中下调。抑制MyoD表达的机制目前尚不清楚。在这里，我们报告了一种抑制MyoD转录的应激反应途径在分化诱导条件下生长的小鼠C2C12成肌细胞中瞬时激活。我们发现，在一些成肌细胞中，翻译起始因子2（eIF2α）的α亚基磷酸化后，C/EBP同源蛋白（CHOP）表达。ShRNA驱动的CHOP表达下调导致早期和更强劲的分化，而其组成性表达相对于野生型成肌细胞延迟分化。表达CHOP的细胞不表达肌源性调节因子MyoD和肌生成素。这些结果表明CHOP直接抑制MyoD基因的转录。为了支持这一观点，CHOP与MyoD基因上游调控区及其活性相关，可降低MyoD增强子区域的组蛋白乙酰化。CHOP与细胞中的组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）相互作用。当与MyoD调节区结合时，这种蛋白质复合物可能会减少组蛋白乙酰化。总的来说，我们的结果表明成肌细胞中应激途径的激活会暂时下调肌生成程序。

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数字

图1
图1。成肌细胞分化过程中应激反应蛋白的瞬时表达。
（A） C2C12成肌细胞在DM中分化，并在不同的时间点提取蛋白质。蛋白质通过Western blotting分离和分析（上面板）。在另一个实验中，C2C12成肌细胞按所述进行分化。细胞固定并用CHOP抗体进行免疫染色分析。CHOP为红色，DAPI为蓝色（下部面板）。棒材，50µm。（B） 3T3 MyoD:ER细胞在含有乙醇或β-雌二醇（0.1µM）的DM中分化24小时。提取蛋白质并用所示抗体进行Western blot分析（上面板）。固定细胞并用CHOP抗体进行免疫染色分析。CHOP为红色，DAPI为蓝色（下部面板）。棒材，50µm。
图2
图2。eIF2αS51A敲除细胞的肌肉分化。
野生型eIF2α和突变型eIF1αS51A成纤维细胞感染了编码MyoD:ER蛋白的病毒。（A） 允许细胞在指定的时间段内在DM和β雌二醇（0.1µM）中分化，并通过Western blot分析蛋白质（左面板）。细胞在DM和乙醇或β-雌二醇（0.1µM）中生长24小时，并通过Western blot分析CHOP和ATF3蛋白（右侧面板）。（B） 细胞系按照A中所述进行生长，并通过Western blot进行分析。（C） 细胞系在DM中培养48小时。用抗MyHC抗体（MF20）对细胞进行免疫染色；MyHC为红色，DAPI为蓝色。棒材，50µm。
图3
图3。CHOP抑制肌源性分化。
（A） 通过感染表达ShRNA的慢病毒，在C2C12成肌细胞中敲除CHOP。通过感染成肌细胞的Western blot分析CHOP蛋白水平。（B） 感染的成肌细胞在DM中生长指定的时间段，并通过Western blot分析肌源性标记物（左面板）。感染的成肌细胞在DM中生长48小时，然后用抗MyHC抗体（MF20）（右面板）对细胞进行免疫染色，MyHC为红色，DAPI为蓝色。根据三个独立的实验计算肌管中的细胞核百分比。给出了平均值和标准误差。棒材，50µm。（C） C2C12成肌细胞感染了编码标记CHOP蛋白的逆转录病毒或作为对照的亲本逆转录病毒。感染的成肌细胞在DM中生长指定的时间段，并通过Western blot分析肌源性标记物（左面板）。感染的成肌细胞在DM中生长48小时，然后用抗MyHC抗体（MF20）（右面板）对细胞进行免疫染色，MyHC为红色，DAPI为蓝色。根据三个独立的实验计算肌管中的细胞核百分比。给出了平均值和标准误差。棒，50µm。
图4
图4。CHOP和MRF的表达是互斥的。
（A） C2C12细胞在DM中培养24小时，用选择性胰蛋白酶法从肌管中分离出单核细胞。对这两个细胞群体进行蛋白质印迹以分析CHOP的表达。（B） C2C12成肌细胞在DM中生长24小时，并用针对CHOP和肌生成素的抗体进行双重染色（左图），或用针对CHOP和MyoD的抗体进行双染色（右图）。蓝色为DAPI，绿色为MyoD和myogenin，红色为CHOP。在三个独立实验中计算CHOP阳性、myogeni阴性和CHOP阳性，MyoD阴性细胞相对于CHOP阳性细胞总数的百分比。给出了平均值和标准误差。棒材，50µm。（C） CHOP在原代卫星细胞中的表达。为了诱导分化，卫星细胞在GM培养基中培养24小时。细胞通过抗MyoD（绿色）和抗CHOP（红色）抗体的免疫染色进行分析。DAPI染色为蓝色。箭头指向CHOP染色阳性的细胞核和MyoD染色阴性的细胞核。棒材，50µm。
图5
图5。CHOP在成肌细胞中起转录抑制物的作用。
（A） 使用编码嵌合体Engrained-CHOP蛋白的逆转录病毒或包含亲本载体的逆转录酶病毒感染C2C12成肌细胞。感染细胞在GM和DM中生长指定的时间段，并通过Western blot分析蛋白质（左面板）。感染的成肌细胞在DM中生长48小时，并用抗MyHC抗体（MF20）进行免疫染色（右图）。MyHC染色为红色，DAPI为蓝色。根据三个独立的实验计算肌管中的细胞核百分比。给出了平均值和标准误差。棒材，50µm。（B） A中描述的感染细胞在DM中生长8小时，并用针对CHOP和MyoD的抗体进行免疫染色分析。控制感染细胞（左侧面板）和Engrained-CHOP感染细胞（右侧面板）。在三个独立的实验中计算了MyoD阳性细胞核相对于细胞核总数的百分比。给出了平均值和标准误差。棒材，50µm。（C） 将感染C2C12的细胞（如A中的细胞）在DM中培养8小时，然后提取总RNA。通过半定量RT-PCR分析MyoD mRNA水平，并通过posphoimager定量。
图6
图6。CHOP抑制MyoD转录。
（A） 如“材料和方法”所述，构建表达嵌合CHOP:ER蛋白的C2C12衍生细胞系。（A） 在乙醇或β雌二醇（0.1µM）存在下培养成肌细胞8小时。使用抗MyoD和抗CHOP抗体对细胞进行免疫染色。DAPI为蓝色，MyoD为绿色，CHOP为红色。计算MyoD阳性核占总核数的百分比。棒材，50µm。（左侧面板）。在另一个实验中，细胞在乙醇或β雌二醇（0.1µM）存在下生长48小时，并通过Western blot分析蛋白质（右图）。（B） 在含有乙醇或β雌二醇（0.1µM）的DM中培养上述相同细胞，培养时间和mRNA水平肌肉转录调节因子和肌生成素通过半定量RT-PCR分析确定。（C） 在添加乙醇或β雌二醇前1小时，在细胞中添加或不添加环己酰亚胺的情况下，在DM和乙醇或β雌酚存在下培养相同的细胞6小时。（D） 分离出具有整合MyoD报告基因（6.0MyoD-nlβGal）的上述细胞克隆（即表达CHOP:ER）。这些细胞在乙醇或β-雌二醇存在下生长20小时。通过酶比色法鉴定βGal的核表达，通过免疫染色鉴定CHOP的表达。箭头指向CHOP阴性的βGal阳性核。在两个独立的实验中计算了βGal阳性核占总核数的百分比。给出了平均值和标准误差。棒材，50µm。
图7
图7。CHOP与MyoD调节序列相关并影响组蛋白乙酰化。
（A） 对在DM中生长24小时的表达Flag-CHOP的C2C12细胞进行染色质IP实验。用抗Flag抗体对片段DNA进行免疫沉淀。对散布在MyoD转录单元上游6 Kb区域和肌生成素转录单元上游2 Kb区域的片段进行PCR扩增。PCR片段在琼脂糖凝胶上分离。扫描凝胶，带强度值如下所示。对于每组PCR引物，输入值设置为1。（B） 表达CHOP:ER嵌合体的C2C12细胞在含有乙醇或β雌二醇（0.1µM）的DM中生长8小时。用抗乙酰化组蛋白H4抗体对片段DNA进行染色质IP分析。对沿着MyoD转录单元上游6kb散布的片段进行PCR扩增。扫描凝胶，带强度值如下所示。对于每组PCR引物，输入值设置为1（C）293T细胞，用所示的表达质粒转染。在温和条件下对细胞进行裂解，并对提取的蛋白质进行分析（左）或用所示的抗Myc或抗HA表位抗体进行免疫沉淀（右）。如图所示，蛋白质通过Western blotting进行分析。
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