The architecture of functional modules in the Hsp90 co-chaperone Sti1/Hop

doi:10.1038/emboj.2011.472

.2012年3月21日；31(6):1506-17.

doi:10.1038/emboj.2011.472。 Epub 2012年1月6日。

Hsp90共伴侣Sti1/Hop中功能模块的结构

安德烈亚斯·施密德¹, 斯蒂芬·拉格利德, 梅丽莎·安·格拉沃特, 阿丽娜·Röhl, 弗兰兹·哈根, 塞巴斯蒂安·K·旺丁格, 马克·考克斯, 奥利弗·德默尔, 克劳斯·李其特, 迈克尔·格罗, 霍斯特·凯斯勒, 约翰内斯·布奇纳

附属公司

PMID： 22227520
预防性维修识别码： PMC3321170型
内政部： 10.1038/emboj.2011.472

Hsp90共伴侣Sti1/Hop中功能模块的结构

安德烈亚斯·施密德等。欧洲工商管理硕士J. 2012.

.2012年3月21日；31(6):1506-17.

doi:10.1038/emboj.2011.472。 Epub 2012年1月6日。

作者

安德烈亚斯·施密德¹, 斯蒂芬·拉格利德, 梅丽莎·安·格拉沃特, 阿利娜·罗尔, 弗兰兹·哈根, 塞巴斯蒂安·K·旺丁格, 马克·考克斯, 奥利弗·德默, 克劳斯·李其特, 迈克尔·格罗, 霍斯特·凯斯勒, 约翰内斯·布奇纳

隶属关系

¹德国加兴慕尼黑理工大学综合蛋白质科学中心化学系。

PMID： 22227520
预防性维修识别码： PMC3321170型
内政部： 10.1038/emboj.2011.472

摘要

Sti1/Hop是真核生物将客户蛋白从Hsp70转移到Hsp90伴侣系统所需的模块化蛋白质。它通过TPR（四三肽重复）结构域同时结合Hsp70和Hsp90。Sti1/Hop包含三个TPR结构域（TPR1、TPR2A和TPR2B）和两个未知结构域（DP1和DP2）。我们发现TPR2A是高亲和力的Hsp90结合位点，TPR1和TPR2B以中等亲和力结合Hsp70。经核磁共振测定，DP结构域显示出高度同源的α-螺旋折叠。这些，尤其是DP2，对体内客户激活非常重要。抑制Hsp90的Sti1的核心模块是TPR2A-TPR2B片段。在晶体结构中，两个TPR结构域通过刚性连接体连接，使其肽结合位点朝向相反方向，并允许TPR2A与Hsp90 C末端结构域和TPR2B与Hsp70同时结合。这两个结构域也与Hsp90中间结构域相互作用。附件TPR1-DP1模块可以用作体内客户端激活所需的TPR2A-TPR2B-DP2片段的Hsp70客户端递送系统。

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数字

图1
TPR2A–TPR2B是抑制Hsp90的核心成分。(A类)Sti1和Sti1碎片的结构域。(B)Sti1片段对yHsp90 ATP酶的影响。2μM yHsp90的ATP酶活性是在30°C下使用ATP再生ATP酶测定法测定的。在2μM的等摩尔浓度下测试Sti1片段的抑制性。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。(C类)抑制片段的滴定（方形：Sti1-FL；圆形：TPR2A–TPR2B–DP2；三角形：TPR3A–TPR2B）。显示了三个独立实验的平均值。(D类)将Ssa1肽PTVEEVD（圆形）或yHsp90肽TEMEEVD（方形）滴定至2μM yHsp90-2μM TPR2A–TPR2B的预成型络合物。

图2
TPR2A–TPR2B模块的结构特征。(A类)TPR2A–TPR2B域的功能区表示。TPR2A–TPR2B片段的主干以灰色显示。结合的pHsp90肽显示为绿色的棒状表示。参与刚性双结构稳定化的三种氨基酸（Y390、E421和R425）以青色表示。(B)链接器域的缩放，如所示(A类). 可能的氢键用虚线表示。(C类)存在C末端Hsp70七肽（pHsp70）的TPR2B结构域。主链以灰色的带状表示，结合肽以黄色的棒状和球状表示。电子密度F类_o个–F类_c（c）地图在δ=2的等高线处以红色显示。相互作用的残基显示为灰色的棒状物。此外，羧基化钳的残基（不与肽进行静电相互作用）以洋红色显示。(D类)结合肽与不同TPR结构域的重叠。黄色：与Sti1 TPR2B结构域结合的pHsp70七肽(C类)，绿色：结合到TPR2A–TPR2B片段中TPR2A结构域凹槽的pHsp90五肽(B)，黑色：绑定到Hop TPR1域的pHsp70七肽（pdb条目代码：1ELW），灰色：绑定到CHIP的pHps90非七肽（pdb条目代码：2C2L）。TPR1:pHsp70、TPR2A:pHssp90和CHIP:pHps90最后三个残基的Cα原子的RMSD分别为0.33、0.49和1.63。(E类,F类)用GRASP和相应肽计算并可视化的可接近分子表面上模拟的静电势的表示。为了清楚起见，肽的C末端天冬氨酸残基被称为天冬氨酰0，前面的残基按降序编号为Val（−1）、Glu（−2）。(E类)pHsp90与TPR2A-TPR2B片段的TPR2A结构域的结合（与(A类)). (F类)pHsp70与TPR2B结构域的结合（与(C类)).

图3
Sti1 DP1和DP2域的结构。(A类)DP1（左）和DP2（右）的NMR结构代表了精炼后模拟退火计算获得的20个最低能量结构的平均结构。DP1的附加N端螺旋线为红色(B)细化后模拟退火计算得到的DP1（左）和DP2（右）的20个最低能量结构的叠加。(C类)DP1（左）和DP2（右）的计算静电势。红色表示负电位，蓝色表示正电位。

图4
核磁共振监测TPR2A–TPR2B与Hsp90-M结构域的结合。(A类)（左）的覆盖¹⁵游离TPR2A–TPR2B（黑色）和与Hsp90-M结构域（红色）的配合物的N-TROSY光谱。（右）的覆盖¹⁵游离Hsp90-M（黑色）和与TPR2A–TPR2B（红色）配合物的N-TROSY光谱。(B)Hsp90-M结合的CSP图¹⁵N TPR2A–TPR2B（左）和TPR2A-TPR2B绑定到¹⁵N Hsp90-M（右）。显著性水平（平均CSP+2x标准差）用虚线表示。(C类)CSP数据映射自(B)TPR2A–TPR2B（左，pdb:3uq3）和Hsp90-M（右，pdb:1hk7）的晶体结构。(D类)（左）之间复合体的PRE数据¹⁵N标记的TPR2A–TPR2B和不同的Proxyl-modified Hsp90-M变体。将添加抗坏血酸前后光谱的信号强度比与每个突变体的残基数绘制成图。TPR2A–TPR2B片段内的域边界已指示。（右）HADDOCK获得的TPR2A–TPR2B和Hsp90-MC之间的络合物模型。未在晶体结构中解析的Hsp90的非结构化C端用红色绘制，MEEVD图案用红色圆点表示。

图5
Sti1变体对客户端活动和Hsp90复合物形成的影响。(A类–C类) Δ*sti1型*在指数生长期间，用DOX诱导表达含有人GR表达质粒和β-半乳糖苷酶报告载体的Sti1片段的酵母细胞。诱导后8–10 h对细胞进行裂解，并对β-半乳糖苷酶活性和裂解物浓度进行分析。实验分为两组，每组三个数值。误差条表示标准误差。(D类)Ssa1和Sti1。通过分析超速离心分析Ssa1和Sti1变体之间的复合形成。沉积剖面转换为dc（c）/d日t吨根据标准程序绘制。总之，在没有Sti1片段（黑色）的情况下培养0.5μM荧光标记的Ssa1，或在10 mM磷酸钾、1 mM TCEP、pH 7.5中与3μM全长Sti1（蓝色）或TPR2A–TPR2B（绿色）络合。离心在20°C和42000 r.p.m下进行(E类)Ssa1和Sti1–yHsp90之间形成三元配合物。在获得yHsp90的情况下，通过分析超速离心分析Ssa1和Sti1变体之间的复合物形成。沉积剖面转换为dc（c）/d日t吨根据标准程序绘制。总之，在没有Sti1片段（未显示）的情况下培养0.5μM荧光标记的Ssa1，或与3μM全长Sti1（黑色）、Sti1–N435A（红色）、TPR2A–TPR2B（绿色）或TPR2A-TPR2B-N435A-（蓝色）在10 mM磷酸钾、1 mM TCEP、pH 7.5中络合。离心在20°C和42000 r.p.m下进行。

图6
Sti1与Hsp90和Hsp70的相互作用模型。Sti1由TPR1（1-126）、DP1（127-197）、TPR2A（257-390）、TPR2B（393-520）和DP2（528-589）组成。TPR1–DP1片段通过约60个残基的非结构化连接体区域柔性连接到刚性TPR2A–TPR2B块。DP2结构域通过六个非结构残基与TPR2B相连。Hsp90 C结构域结合TPR2A和Hsp90-M结构域TPR2B。这导致Hsp90 ATP酶受到抑制。由于亲和力较高，Hsp70最初与TPR1结合。DP1可以稳定绑定的客户端。随后，Hsp70和客户端被转移到TPR2B–DP2。然后从这个位置将客户转移到Hsp90。

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