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.2011年12月23日；44(6):864-77.
doi:10.1016/j.molcel.2011.10.015。

线粒体丙酮酸脱氢酶激酶1的酪氨酸磷酸化对癌症代谢很重要

日本麻生太郎 1, 范军（Jun Fan）, Tae-Wook Chung先生, 凯瑟琳·利思戈, 徐旺, 谢建新, 清远阁, 丁磊谷, 罗伯特·德·波拉基维茨（Roberto D Polakiewicz）, 约翰内斯·罗塞尔, 乔治亚·Z·陈, 提图斯·J·博根, 萨加·罗尼亚尔, 海安福, 法德洛·R·库里, 苏敏康, 陈静
附属公司

线粒体丙酮酸脱氢酶激酶1的酪氨酸磷酸化对癌症代谢很重要

日本麻生太郎等。 分子电池. .

摘要

许多肿瘤细胞依靠有氧糖酵解而不是氧化磷酸化来持续增殖和生存。据信，Myc和HIF-1通过上调丙酮酸脱氢酶（PDH）激酶1（PDHK1）的基因表达促进了这种代谢转换，PDHK1磷酸化并使线粒体PDH失活，从而使丙酮酸脱水酶复合物（PDC）失活。在此，我们报告了酪氨酸磷酸化通过促进ATP和PDC结合来增强PDHK1激酶活性。在一些癌细胞中，功能性PDC可以在基质外的线粒体中形成，PDHK1在人类癌症中通常被定位于不同线粒体隔室的多种致癌酪氨酸激酶磷酸化。癌细胞中磷酸化缺陷、催化性低形态PDHK1突变体的表达导致缺氧条件下细胞增殖降低，氧化磷酸化增加，丙酮酸的线粒体利用率增加，异种裸鼠肿瘤生长减少。总之，酪氨酸磷酸化激活PDHK1以促进Warburg效应和肿瘤生长。

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数字

图1
图1。FGFR1直接磷酸化并激活PDHK1
（A） PDHK1的示意图。显示了三个已鉴定的FGFR1-直接酪氨酸磷酸化位点，包括Y136、Y243和Y244。（B） 活性重组FGFR1（rFGFR1）在酪氨酸残基处直接磷酸化纯化的GST标记的PDHK1在体外激酶分析。通过特异性磷酸化Tyr抗体（pY99）检测磷酸化rFGFR1和GST-PDHK1。（C） 从共同表达FGFR1野生型（WT）的细胞中纯化的GST-PDHK1，但不是FGFR1激酶死亡型（KD），显示在一个在体外以重组丙酮酸脱氢酶A（rPDHA）为底物测定PDHK1激酶(上面的). Western blot显示，GST-PDHK1在FGFR1 WT共同表达的细胞中被酪氨酸磷酸化，但KD突变体没有表达(降低). （D） TKI258对FGFR1的抑制（2小时）导致共同表达FGFR1 WT的细胞中PDHK1的酪氨酸磷酸化水平降低(左边). 同时表达FGFR1 KD和GST-PDHK1的细胞作为阴性对照。Western blot结果显示FGFR1与PDHK1及其底物PDHA1在线粒体中共定位(正确的). （E） TKI258抑制FGFR1（2小时）导致白血病KG1a细胞（FOP2-FGFR1）PDHA1的S293磷酸化水平降低(左边)和肺癌H1299细胞（FGFR1）(正确的). （F）左侧PDHK抑制剂DCA靶向PDHK1导致KG1a和H1299细胞中PDHA1的S293磷酸化水平降低。赖特：特定shRNA抑制PDHK1可降低H1299细胞中PDHA1的S293磷酸化水平。数字代表PDHK1特定带的相对强度(上面的)或磷酸-PDHA1（S293；降低)未经人类PDHK1（hPDHK1）shRNA处理，将其归一化为对照样品的值。
图2
图2。FGFR1依赖性酪氨酸磷酸化通过促进ATP和PDC结合激活PDHK1
（A） 用小球将GST-PDHK1蛋白拉下，用蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）处理，然后用活化的rFGFR1处理。然后将珠粒与重组PDHA1在在体外激酶分析。免疫印迹法检测PDHA1的S293磷酸化(左边).赖特面板表示磷酸化PDHA1 E1α特定谱带的相对强度，这些谱带归一化为对照样品（GST-PDHK1 WT）的值，而不使用rFGFR1处理。（B） 使用Pymol制作的PDHK1结构的卡通表示（PDB ID:2Q8G）（Kato等人，2007）(网址：www.pymol.org). Y243和Y244靠近ATP盖（蓝色），并预测ATP结合的位置（以AMP-PNP结合的二聚体PDHK4结构PDB ID:2E0A为模型，灰色）。Y136更接近于AZD7545（绿色），后者是一种PDHK1抑制剂，可破坏功能性丙酮酸脱氢酶复合物（PDC）的形成。（C） FGFR1在Y243或Y244处磷酸化，而不是在Y136处磷酸化导致与PDHK1的ATP结合增加。从转染的293T细胞裂解物中用珠拖出GST-PDHK1变体，并与活性rFGFR1孵育，然后与[α]孵育-32P] ATP。未绑定的[α-32P] ATP被冲走。保留[α-32P] PDHK1上的ATP用闪烁计数器测量。Y136（D）、Y243和Y244（E）的（D-E）FGFR1依赖性磷酸化促进PDHK1与PDC的结合。用小球将GST-PDHK1变异体拉下并与活性rFGFR1孵育，然后与293T细胞的全细胞裂解物孵育。免疫印迹法检测结合PDC E2蛋白和PDHA1 E1α蛋白。上部面板显示了一个典型实验的免疫印迹结果。下部面板显示了两个独立实验的总结结果，这两个实验代表了PDHA1 E1α和PDC E2与PDHK1结合的特定带的相对强度，这些带在不使用rFGFR1处理的情况下被归一化为对照样品的值。误差条表示平均值+/-SD。
图3
图3。FGFR1磷酸化癌细胞线粒体PDHK1
（A-B）PDHK1 Y243由rFGFR1在在体外激酶分析（A）和在表达FGFR1（B）的细胞中，通过特异性识别PDHK1磷酸化Y243的抗体检测。（C） 免疫印迹显示TKI258在肺癌H1299细胞中靶向FGFR1(左边)或白血病KG1a细胞(正确的)降低PDHK1 Y243的磷酸化。（D） 慢病毒shRNA在H1299细胞中连续48小时敲除FGFR1导致PDHK1 Y243和PDHA1 S293的磷酸化水平降低。（E） Western blot结果显示FGFR1与PDHK1及其底物PDHA1在KG1a线粒体中共定位(左边)和H1299(正确的)单元格。（F） 免疫印迹结果显示FGFR1定位于线粒体，线粒体COX IV和细胞溶质β-肌动蛋白作为KG1a的对照标记(左边)和H1299(正确的)单元格。（G） 免疫荧光分析显示FGFR1与线粒体标记物MitoTracker®线粒体选择性染料共定位，但与核标记物DAPI在H1299细胞中不共定位(左上角). shRNA对FGFR1的敲除(右侧面板)导致FGFR1的线粒体定位降低(下左).
图4
图4。FGFR1定位于线粒体外膜，癌细胞基质外的线粒体可形成功能性PDC
（A） 透射电镜下FGFR1在H1299细胞中的线粒体定位。左侧面板显示无一级抗体的对照组。中部面板显示FGFR1在H1299细胞线粒体中的定位，箭头表示线粒体FGFR1的典型染色。赖特面板显示了shRNA击倒FGFR1的对照。比例尺：0.5μm。（B） 肺癌H1299和白血病KG1a细胞线粒体外膜中全长FGFR1和FOP2-FGFR1融合酪氨酸激酶的定位。Tom40、Cyto C、复合物I 39-kDa蛋白和MnSOD分别是线粒体外膜（Om）、膜间隙（IMS）、内膜（Im）和基质（Ma）的标记物。（C） 蛋白酶K保护实验，在Triton X-100存在和不存在的情况下用蛋白酶K处理分离的线粒体，然后进行Western blot。（D-E）左侧：PDC介导的转换活动14C-标记丙酮酸14C标记CO2在H1299细胞（D）和KG1a细胞（E）的Om、IMS和Ma等线粒体亚组分中检测到。误差条表示平均值+/-SD。赖特：蛋白质印迹结果显示PDHA1（E1）、E2、E3和E3BP在指示的线粒体亚组分中的表达水平。标记物包括Tom40、Cyto C和MnSOD。
图5
图5。PDHK1的Y243通常被定位于癌细胞线粒体的致癌酪氨酸激酶磷酸化
（A） 免疫印迹法检测不同癌细胞中PDHK1的Y243磷酸化。显示了PDHA1在S293的磷酸化水平的Western blot结果。（B-D）活性、重组ABL（B）、JAK2（C）和FLT3（D）直接磷酸化相应的Y243处PDHK1在体外激酶分析。（E） 免疫印迹显示伊马替尼在K562细胞中靶向BCR-ABL(左边)，HEL细胞中JAK2由AG490(中间的)或Mv4中TKI258的FLT3-ITD；11个单元格(正确的)降低PDHK1 Y243的磷酸化。（F） 免疫印迹结果显示BCR-ABL(左边)，JAK2(中间的)和FLT3(正确的)定位于线粒体，线粒体COX IV和细胞溶质MEK1分别作为白血病K562（BCR-ABL）、HEL（JAK2）和Molm14（FLT3）细胞的对照标记物。细胞质中也检测到BCR-ABL和JAK2，但未检测到FLT3。整合素β1和PARP分别是质膜和细胞核的标记物。（G） 亚分馏结果表明，BCR-ABL和JAK2定位于K562和HEL细胞的线粒体基质中(左边和中间的FLT3定位于Molm14细胞的线粒体外膜(正确的). Tom40、Cyto C、复合物I 39-kDa蛋白和MnSOD分别是线粒体外膜（Om）、膜间隙（IMS）、内膜（Im）和基质（Ma）的标记物。
图6
图6。在H1299细胞中表达催化活性较低的小鼠PDHK1突变体，包括Y134F和Y239/240F，导致缺氧条件下增殖降低和氧化磷酸化增加
（A） 免疫印迹显示，shRNA-介导的慢病毒转导在H1299细胞中稳定敲除内源性人类PDHK1（hPDHK1），并拯救包括WT、Y134F突变体和Y239/240F双突变体在内的标记小鼠PDHK1蛋白的表达。mPDHK1的Y134、Y239和Y240分别对应于hPDHK1中的Y136、Y243和Y244。（B） 在H1299细胞中拯救表达mPDHK1 Y134F或Y239/240F突变体会导致在缺氧条件下（1%氧气）细胞增殖率降低，但在正常氧气张力下（常氧；17%氧气）细胞的增殖率不会低于表达mPD香港1 WT的细胞。细胞增殖通过接种后48小时和96小时每个细胞系的细胞数来确定（n＝3；*：0.01<第页<0.05). 误差线代表平均值+/-SD。与表达mPDHK1 WT的细胞相比，（C-E）Y134F和Y239/240F挽救细胞的耗氧率（C）显著升高，在常氧（D）下细胞内ROS生成增加，在常压（E）下乳酸生成显著降低。在乳酸测定之前，培养基与细胞培养1小时。误差条代表平均值+/-SD。（F-G）与表达mPDHK1 WT的细胞相比，寡霉素处理导致Y134F和Y239/240F救援细胞中ATP生成抑制（F）增加，增殖减少（G）。误差条代表均值+/-SD（H-I）从表达mPDHK1 Y239/240F的拯救细胞分离的线粒体显示丙酮酸消耗率（H）和PDC介导的14C-标记丙酮酸14C标记CO2（一） 与从WT拯救细胞中分离的线粒体相比。误差条表示平均值+/-SD。
图7
图7。PDHK1的磷酸化依赖性激活是通过PDHA1磷酸化和失活介导的，这对异种移植裸鼠的肿瘤生长很重要
（A） PDHA1 S293D突变体的表达，但不表达PDHA1 WT或S293A(降低)导致O显著降低2mPDHK1 Y239/240F在H1299救援电池中的消耗量，但在WT救援电池中没有(上面的). （B-E）在mPDHK1 Y239/240F的挽救细胞中PDHA1 WT、S293A或S293D突变体的表达不影响正常氧条件下的细胞增殖（B；左边); 然而，PDHA1 S293D突变体的表达，而不是WT或S293A突变体，导致mPDHK1 Y239/240F救援细胞在细胞增殖方面对缺氧的敏感性降低（B；正确的)增加乳酸生成（C），降低对寡霉素治疗的ATP水平（D）和细胞增殖（E）的敏感性。误差条表示平均值+/-SD。（F）左侧：显示了一只典型裸鼠（#1743）的解剖肿瘤（用红色箭头表示），该裸鼠左翼注射了mPDHK1 WT H1299细胞，右翼注射了Y239/240F H1299。赖特：Flag-mPDHK1 WT和Y239/240F的表达，以及肿瘤裂解物中PDHK1和PDHA1的磷酸化水平。（G） 与mPDHK1 WT细胞相比，Y239/240F拯救细胞在异种裸鼠体内的肿瘤形成显著减少(第页值由配对学生的t吨测试）。
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