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.2011年11月；9（11）：e1001187。
doi:10.1371/journal.pbio.1001187。 Epub 2011年11月1日。

SAP杂合表达女性携带者的分析揭示了XLP中EBV易感性的分子发病机制

巴勒斯坦乌玛明丹 1, 卡罗尔·洛, 陈净心, 安德鲁·德·希斯洛普, 何鸿燊（Edwin Ho）, Tri Giang Phan公司, 埃莉萨·迪尼克, 马修·库克, D肖恩·里明顿, 沙伦·乔, 罗家杰, 弗兰克·阿尔瓦罗, 克莱尔·布斯, H鲍比·加斯帕, 亚历山德罗·莫雷塔, 拉吉夫·坎纳, 艾伦·B·里金森, 斯图亚特·唐耶（Stuart G Tangye）
附属公司

SAP杂合表达女性携带者分析揭示XLP患者EBV易感性的分子发病机制

乌迈曼丹·巴伦迪拉等。 公共科学图书馆生物学. 2011年11月.

摘要

X连锁淋巴增生性疾病（XLP）是一种由编码SAP的SH2D1A突变引起的原发性免疫缺陷。SAP在白细胞受体SLAM家族诱导的信号通路中发挥作用。XLP的一个决定性特征是对EB病毒（一种B淋巴细胞性病毒，但对其他病毒不敏感）的感染非常敏感。尽管先前的研究已经确定了XLP患者淋巴细胞的缺陷，但SAP在控制EBV感染方面的独特作用仍未解决。我们使用女性XLP携带者描述了一种新的方法来解决这个问题，女性XLP携带者由于随机X灭活而同时包含SAP（+）和SAP（-）细胞。这相当于小鼠混合骨髓嵌合体的人类等效物。虽然CMV和流感特异性记忆CD8（+）T细胞分布在SAP（+）和SAP（-）人群中，但EBV特异性细胞仅为SAP（+。EBV对SAP（+）细胞的优先招募反映了EBV对B细胞的嗜性，以及CD8（+）T细胞对SAP表达的要求，以使其对B细胞而非其他细胞类型的Ag呈递作出反应。通过阻断SLAM受体NTB-A和2B4，克服了SAP（-）克隆对Ag呈递B细胞反应的无能，而成纤维细胞上NTB-A的异位表达抑制了SAP（–）CD8（+）T细胞的细胞毒性，从而证明SLAM受体在没有SAP的情况下获得抑制功能。创新的XLP携带者模型使我们能够在缺乏相关动物模型的情况下揭示XLP患者对EBV感染独特易感性的机制。我们发现这反映了抗原呈递细胞的性质，而不是EBV本身。我们的数据还确定了一种病理信号通路，可作为治疗严重EBV感染患者的靶点。该系统可以用于研究其他人类疾病，其中可以利用随机X染色体失活的杂合基因表达。

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数字

图1
图1。XLP杂合子携带者的免疫特征。
（A） 三个具有代表性的女性XLP携带者受影响外显子的正向（上部）和反向（下部）基因组DNA序列。（B） 本研究中使用的七种XLP载体中的野生型和突变等位基因及其导致的氨基酸变化。用抗CD20、CD27、IgG/A/E或CD3、TCRVβ11和TCR Vα24单克隆抗体标记XLP携带者的（C–E）PBMC。表达CD27的（C，F）B细胞（即记忆细胞）的频率；（D） 表达同型转换免疫球蛋白的记忆B细胞；然后测定（E、G）NKT细胞。（C）、（D）和（E）中的点图所示的值分别对应于总存储器B细胞、同种型切换存储器B细胞和NKT细胞的平均频率。健康对照组的参考值之前已发布，，。
图2
图2。XLP携带者T细胞和NK细胞中杂合SAP的表达。
来自健康供体（A）或XLP患者（B）的（A，B）PBMC与抗CD3、CD4、CD8、CD56和CD20单克隆抗体一起孵育。然后固定并渗透细胞，并用同型对照（灰色直方图）或抗SAP（红色直方图”）单克隆抗体标记。SAP在CD3中的表达+T细胞，CD8+和CD4+T细胞、B细胞（CD20+)和NK（CD3−CD56型+)然后对细胞进行测定。用CD3、CD8、CD45RA、CCR7、CD56、TCRVβ11、TCRV-α24或CD20特异性单克隆抗体标记XLP携带者的（C–F）PBMC。然后将细胞固定并渗透，并用同型对照（蓝色直方图）或抗SAP单克隆抗体（红色直方图。SAP表达和SAP频率−和SAP+细胞测定：（C）总CD8+T细胞和幼稚细胞亚群（CD45RA+CCR7号机组+)，中央存储器（CD45RA−CCR7号机组+)，效应器存储器（CD45RA−CCR7号机组−)，或TEMRA公司（CD45RA+CCR7号机组−)细胞；（D） NK细胞（CD3−CD56型+); （E） NKT细胞（CD3+TCRVβ11+TCRVα24+); 和（F）B细胞（CD20+).
图3
图3。SAP的选择性招聘+细胞进入EBV特定存储器CD8+T细胞室。
（A，B）XLP载体PBMC用特异性MHCⅠ类/肽复合物和抗CD8单克隆抗体标记；然后将细胞固定/渗透并与抗SAP单克隆抗体孵育。SAP的比例+和SAP−然后测定对不同病毒具有特异性的细胞。（A）中的点图描述了四聚体中SAP的表达+来自携带CMV、Flu和EBV特异性CD8的可检测人群的细胞+T细胞。（B）中的图表描述了SAP的比例+和SAP−EBV、CMV或流感特异性CD8中的细胞+来自五种不同XLP载体的T细胞。来自XLP携带者的（C–E）PBMC未经EBV、CMV或Flu肽或PMA/离子霉素刺激或刺激。SAP表达（C）IFN-γ或（D）CD107a−和SAP+CD8（CD8）+4–6小时后测定T细胞。这些值代表SAP反应细胞的比例−或SAP+（E）CD8分析所得数据汇总+不同载体的T细胞通过SAP测定IFN-γ分泌或脱颗粒（即CD107a表达）+和SAP−细胞对EBV、CMV和Flu肽的反应。“n个“表示针对每个病毒反应研究的携带者数量。
图4
图4。SAP缺陷CD8+T细胞对B细胞靶点没有反应。
活力+和SAP−CD8（CD8）+从无关的XLP携带者分离的（A，B）CMV或（C–E）Flu特异性T细胞克隆与（A）自体B-LCL、（B）B-LCL或HLA匹配的单核细胞、或（C-E）B-LCLs或HLA配对的成纤维细胞培养，这些细胞用无关或同源肽脉冲处理4–6小时。用PMA/离子霉素刺激作为阳性对照。然后测定IFN-γ（A）或CD107a（B–E）的表达。（D）和（E）中的图表表示流感特异性SAP的百分比+或SAP−诱导细胞表达CD107a+在用肽脉冲B-LCL（D）或成纤维细胞（E）刺激之后。这些值表示使用三种不同流感特异性SAP的实验的平均值±sem+或SAP−克隆。（F、G）SAP+和SAP−流感特异性CD8+T细胞克隆与51Cr标记的B-LCL（F）或成纤维细胞（G）用其同源肽脉冲4-6小时。细胞毒性通过标准铬释放试验测定。结果代表了使用不同SAP克隆对进行的两个实验−和SAP+细胞。图S2中显示的对CMV脉冲B-LCL和单核细胞反应的数据来自使用不同SAP对的实验−和SAP+克隆**第页<0.05.
图5
图5。SLAM家族受体在CD8上的表达+XLP携带者的T细胞亚群。
用CD8、CD45RA和CCR7以及2B4、NTB-A、CD229、SLAM、CD84或CRACC特异性单克隆抗体对XLP携带者的PBMC进行染色；固定和渗透后检测SAP的表达。SAP上每个SLAM系列成员的表达−和SAP+天真、中央记忆、效应记忆和TEMRA公司CD8（CD8）+通过CD45RA门控检测T细胞+CCR7号机组+，CD45RA−CCR7号机组+，CD45RA−CCR7号机组−和CD45RA+CCR7号机组−单元格。（A）中的直方图来源于对一个载波的分析。所有载体的数据如图S3所示。（B） SAP上SLAM家族受体表达的代表性直方图+和SAP−CD8（CD8）+T细胞克隆。
图6
图6。SLAM家族受体配体由不同类型的APC差异表达。
健康对照组的PBMC(n个 = 6） 健康对照组和XLP运营商的B-LCL(n个 = 8） ，单核衍生DC(n个 = 4） 和人类成纤维细胞(n个 = 2） 用SLAM家族受体CD48、NTB-A、CD229、SLAM、CD84或CRACC特异性单克隆抗体染色。通过CD14和CD20的表达分别鉴定PBMCs中的单核细胞和B细胞。通过CD1a、CD11c和MHC II类的表达鉴定DC。（A） SLAM家族配体在人类成纤维细胞、休眠原代B细胞、B-LCL、单核细胞和体外衍生DC上的表达直方图。（B） 不同APC上不同分子表达的平均荧光强度（F，成纤维细胞；B，静止原代B细胞；L，B-LCL；M，单核细胞；DC，树突状细胞）。
图7
图7。SLAM家族受体抑制Ag特异性SAP的功能−CD8（CD8）+T细胞。
（A） 测定B-LCL和霍奇金淋巴瘤细胞株HDLM2上SLAM受体和MHCⅠ类的表达。（B） CD8的能力+通过培养CMV-特异性SAP评估B-LCL和HDLM2细胞激活的T细胞−（红色直方图）和SAP+（蓝色直方图）CD8+带有肽脉冲靶细胞的T细胞。这些值表示表达CD107a的SAP的百分比−和SAP+与不同的靶细胞孵育4-6h后检测到细胞。（C、D）SAP+和SAP−CD8（CD8）+CMV特异性T细胞克隆与肽脉冲自体B-LCL在单独或不单独存在NTBA特异性单克隆抗体、2B4单克隆抗体或联合存在的情况下培养。SAP表达CD107a−和SAP+CD8（CD8）+在4-6小时后测定T细胞。这些值代表响应细胞的比例。（C）和（D）中的数据表示使用不同对CMV特异性CD8进行的独立实验+T细胞克隆。（E） 亲代成纤维细胞上NTB-A的表达（红色直方图）或转染表达NTB-A（蓝色直方图。（F、G）SAP+（F） 和SAP−（G） CMV特定CD8+T细胞克隆与51Cr标记的亲代（红色）或NTB-A表达的（蓝色）成纤维细胞靶细胞。细胞毒性在4小时后测定，用靶细胞溶解百分比表示。每个值是一式三份样品的平均值±扫描电镜，代表使用三对不同的SAP进行的实验−和SAP+CMV特定CD8+T细胞克隆。
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参考文献

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