跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
。2011年12月23日；286（51）：44116-44125。
doi:10.1074/jbc。M111.276931。 Epub 2011年11月2日。

肌钙蛋白相关转录因子-A复合物激活肺成纤维细胞I型胶原表达

拉里·卢辛格 1, 卡桑德拉·帕特诺 1, 芭芭拉·史密斯 2, 马修·D·莱恩 三
附属公司

肌钙蛋白相关转录因子-A复合物激活肺成纤维细胞I型胶原表达

拉里·卢辛格等。 生物化学杂志。 。

摘要

肺纤维化的特征是富含胶原蛋白的细胞外基质过度沉积。胶原蛋白在肺间质内的积聚导致呼吸功能受损。此外，纤维化肺内的平滑肌肌动蛋白阳性肌成纤维细胞有助于疾病进展。由于胶原蛋白和平滑肌细胞α-肌动蛋白在纤维化过程中协调表达，因此对以下假设进行了验证：心肌蛋白家族的特异转录调节因子也可能调节肌成纤维细胞中胶原蛋白基因的表达。肌卡相关转录因子（MRTF）通过与CArG盒调节元件（CC（A/T）6GG）上的血清反应因子（SRF）相互作用，是肌成纤维细胞分化的重要调节因子。MRTF-A反式激活的I型胶原基因报告子在肺肌成纤维细胞中高达100倍。相对于对照，肺成纤维细胞中使用显性阴性MRTF-A亚型、靶向MRTF-A的shRNA或MRTF-A的基因缺失的功能性MRTF-A的缺失显著破坏了I型胶原的合成。对COL1A2近端启动子的分析显示了一个非经典的CArG盒（CCAAACTTGG），其两侧有几个对MRTF-a激活重要的Sp1位点。染色质免疫沉淀实验证实MRTF-A、SRF和Sp1结合到COL1A2启动子的同一区域。非经典CArG盒或Sp1位点的突变显著干扰了COL1A2的MRTF-A激活。总之，我们的研究结果表明，MRTF-A是肺成纤维细胞胶原合成的一个重要调节器，并表现出对SRF和Sp1功能的依赖性，以增强胶原表达。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
肌球蛋白相关转录因子能有效激活I型胶原启动子。 A、，I型胶原近端启动子包含几个进化上保守的调控元件，包括Sp1(灰色矩形)，等(白色圆圈)和SMAD（SBE）(黑色椭圆形)。此外，在−326（CCAAACTTGG）和−193（CCAAATTTAAG）处发现了两个潜在的SRF-结合CArG-like序列(黑色方块).B、，大鼠肺成纤维细胞（RFL6）与−351共转染COL1A2公司具有心肌蛋白家族表达的启动子（100 ng/well）构建MRTF-A、MRTF-B和带有CMV-β的心肌蛋白（100 ng/well），以使转染效率正常化。归一化荧光素酶活性表示为空载体对照的倍数。C、，RFL6细胞被转染为A类随着MRTF-A含量的增加。D、，转染−311的RFL6细胞COL1A1公司启动子和增加MRTF-A浓度。E中，RFL6成纤维细胞用（100ng）MRTF-A和一组缺失的COL1A2公司荧光素酶报告子构建。相对于野生型构建物（−351/+55 bp），评估了各种截断的活性。结果代表了三个独立实验，每个实验一式三份。
图2。
图2。
MRTF-A调节人肺成纤维细胞中I型胶原的合成。 A、，慢病毒编码控制shRNA短暂感染IMR90肺成纤维细胞48小时(shNTC公司,白色条)或靶向MRTF-A的shRNA(shMRTF-A型,黑色条)。通过qRT-PCR测量MRTF-A、hnCOL1A2、COL1A2和SMA的信息水平，并将其归一化为shNTC感染细胞中的信息水平。B、，对感染慢病毒的IMR90细胞制备的总细胞裂解物进行Western blot分析。对裂解液进行I型胶原（Southern Biotech）、α1（I）型胶原（Rockland）、MRTF-A和SMA分析，并归一化为GAPDH。C、，用强力霉素感染IMR90细胞(Dox公司)显性阴性MRTF-A的控制性腺病毒载体(广告-DN-MRTF-A)如“实验程序”所述48 h。用（+）或不使用强力霉素（−）处理细胞以控制DN-MRTF-A的表达，并对I型胶原（Southern Biotech）、SMA、FLAG进行Western blot分析，并将其归一化为GAPDH。D、，如“实验程序”所述，用强力霉素控制的MRTF-A腺病毒载体（Ad-MRTF-A）感染IMR90细胞48小时。用（+）或不使用强力霉素（-，并归一化为微管蛋白。结果代表了三个独立的实验。
图3。
图3。
Sp1位点有助于MRTF-A胶原蛋白的反式激活。 A、，IMR90成纤维细胞（30000/孔）转染MRTF-A（40 ng/孔）和一系列COL1A2公司启动子突变和缺失结构（100纳克/孔）（如“实验程序”和图1所示A类) (*,第页< 0.05; **,第页< 0.01).B、，IMR90细胞被瞬时转染，如A类带−224COL1A2公司野生型和Sp1突变体构造（在“实验程序”和图1中描述A类)。正常化荧光素酶活性表示为野生型-224/+55报告者的百分比（*，第页< 0.05). 结果是三个独立实验的平均值。
图4。
图4。
MRTF-A与Sp1和SRF共同占据胶原蛋白启动子。 A、，用MRTF-A（40 ng）和100 ng−351瞬时转染IMR90细胞COL1A2公司包含CArG-like序列突变的启动子结构（在“实验程序”中描述）。标准化萤光素酶活性相对于−351表达COL1A2公司构造。B、，IMR90细胞以2×10的密度接种4/厘米2培养16h后进行交联和染色质分离。每次免疫沉淀反应使用7μg总染色质等分试样。ChIP样品(n个=3）通过定量RT-PCR检测，并使用每个引物组的基因组DNA标准曲线的线性回归进行量化。从ChIP值中减去IgG扩增，并根据COL1A2公司结果是三个独立实验的平均值。
图5。
图5。
Sp1位点对MRTF-A依赖性胶原表达的贡献。 A、，用二甲基亚砜处理IMR90细胞24小时（对照组，白色条)或50 n米米特拉霉素A(米特,黑色条)，抑制转录因子与富含GC的DNA元素的结合。通过定量RT-PCR测定hnCOL1A2、COL1A2和SMA的表达水平(n个= 3). 结果是相对于对照组表达的。B、，在处理为A类I型胶原（Southern Biotech）、MRTF-A和SMA。将印迹归一化为GAPDH。C、，用强力霉素控制的腺病毒MRTF-a载体感染IMR90细胞，并在强力霉素存在（+）或不存在（-）的情况下进行治疗(Dox公司)控制MRTF-A表达或米特拉霉素A调节转录因子结合。Western blot分析I型胶原、SMA、FLAG，并归一化为GAPDH。数据是三个独立实验的代表。
图6。
图6。
MRTF-A依赖性胶原启动子活性由SRF和Sp1调节。 A、，不表达Sp1同源物的DMel.2细胞瞬时转染胶原蛋白COL1A2公司和COL1A1公司荧光素酶报告者在同等数量的MRTF-A、Sp1和SRF存在下。荧光素酶值标准化为MRTF-A激活百分比。B、，将−351转染IMR90细胞COL1A2公司和MRTF-A以及两种不同的SRF显性负表达载体（SRFΔTAD和SRTFΔDBD）。荧光素酶活性表示为MRTF-A激活的百分比。结果是三个独立实验的平均值。
图7。
图7。
MRTF-A KO肺成纤维细胞胶原表达降低。 A、，低代MRTF-A WT和MRTF-KO小鼠肺成纤维细胞(n个=3），电镀24 h，并进行I型胶原（Southern Biotech）、MRTF-A和SMA的Western blot分析。将印迹归一化为GAPDH。B、，小鼠肺成纤维细胞在250μ米抗坏血酸48小时。通过Sircol分析测定分泌的胶原蛋白水平，并将其归一化为细胞裂解液中的总蛋白水平。C、，用MRTF-A腺病毒载体感染MRTF-A-KO肺成纤维细胞，并用不同剂量的多西环素治疗，以控制MRTF-A-的表达以及250μ米抗坏血酸盐48小时。通过蛋白质印迹分析胶原I、MRTF-A、SMA的总细胞层蛋白和分泌蛋白。将印迹归一化为GAPDH。结果代表了两个独立的实验。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Wilson M.S.、Wynn T.A.（2009）《粘膜免疫学》。2, 103–121-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Wynn T.A.（2008）《病理学杂志》。214, 199–210-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Kuhn C.、McDonald J.A.（1991）《美国病理学杂志》。138, 1257–1265-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Zhang K.、Rekhter M.D.、Gordon D.、Phan S.H.（1994）《美国病理学杂志》。145, 114–125-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Adler K.B.、Low R.B.、Leslie K.O.、Mitchell J.、Evans J.N.（1989）《实验室投资》。60473–485-公共医学

出版物类型