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.2011;6（10）：e26496。
doi:10.1371/journal.pone.0026496。 Epub 2011年10月21日。

小鼠感光细胞连接纤毛的基底复合体中的中心体蛋白-中心蛋白

约翰娜·穆尔汉斯 1, 约翰·赫尔穆特·布兰德斯特, 安德烈亚斯·吉斯尔
附属公司

小鼠感光细胞连接纤毛的基底复合体中的中心体蛋白-中心蛋白

约翰娜·穆尔汉斯等。 公共科学图书馆一号. 2011.

摘要

背景：周心蛋白（Pericentrin，Pcnt）是周心物质的一种保守蛋白，是众多蛋白质的多功能支架，在微管组织中起着重要作用。最近的研究表明，Pcnt突变与一系列疾病相关，包括原发性侏儒症和纤毛病。迄今为止，已知有三种来自小鼠和人类同源基因的Pcnt剪接变异体。

主要发现：我们制备了一种检测所有已知Pcnt剪接变体的特异性Pcnt抗血清，并检测了Pcnt在小鼠纤毛组织、嗅觉上皮和视网膜中的细胞和亚细胞分布。我们首次在小鼠视网膜光感受器的基底体复合体中鉴定了Pcnt及其中心体相互作用伙伴。光受体在形态和功能上可分为感光外段和组成细胞代谢功能的内段。这两个隔室通过一个修饰的、专门的、非活动的纤毛连接起来，纤毛连接在一起。在这里，Pcnt与负责两个隔室之间运输过程的整个蛋白质机械共同定位。令人惊讶的是，感光细胞表达了一个小的Pcnt剪接转录物，很可能是Pcnt S的修饰变体，而嗅上皮的受体神经元中没有这种转录物。

结论：我们的研究结果表明，几种Pcnt变体在不同的纤毛组织和感觉神经元（如小鼠的嗅上皮和视网膜）中具有不同的功能作用。不同Pcnt剪接转录物的个体拼凑似乎反映了Pcnt功能的复杂性，与Pcnt基因突变相关的异质性临床表现证实了这一假设。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。Pericentrin抗血清MmPeriC1的特性。
（A） 已知和公布的Pcnt剪接变体的方案：Pcnt B（360，登录号（AN）：NP_032813或BAF36559）、Pcnt A（AN：部分，AAO24322.1）和Pcnt S（250，BAF36560）。生成MmPeriC1抗血清所针对的280个氨基酸表位以灰色表示。（B-D）NIH 3T3小鼠成纤维细胞中Pcnt（B，绿色）、ac.微管蛋白（C，红色）和DAPI（D merge，蓝色）的三重标记。在初级纤毛（PC）的BBC（箭头）处，Pcnt与ac.微管蛋白部分共定位。（E） 高分辨率三维重建显示Pcnt（绿色）包裹着PC的BBC（红色，ac.微管蛋白）。（F，G）使用MmPeriC1抗血清进行Western blot分析。（F） 抗血清检测到360kDa和240-250kDa蛋白带。（G） MmPeriC1抗血清与抗原（重组融合蛋白）的预孵育阻止了两条带的免疫检测。（H） MmPeriC1抗血清与抗原的预吸附导致BBC在用ac.tubulin标记的初级纤毛处没有Pcnt染色。比例尺：5µm（D，H）。
图2
图2。NIH 3T3小鼠成纤维细胞周期中Pericentrin的定位。
（A–D）NIH 3T3小鼠成纤维细胞内源性Pcnt（A，绿色）、γ-微管蛋白（B，红色）三重染色作为中心体标记，DAPI（D，蓝色）作为核标记。（C–D）染色的合并显示了Pcnt在分裂细胞（箭头）和非分裂细胞（如箭头所示）中心体的定位。（E–H）NIH 3T3小鼠成纤维细胞经内源性Pcnt（E，绿色）、α-微管蛋白（F，红色）和DAPI（H，蓝色）染色作为微管标记。（G–H）在合并图片中，Pcnt定位于中心体。比例尺：5µm（H，D）。
图3
图3。Pericentrin在小鼠嗅纤毛的定位。
（A–C）冷冻切片通过成年小鼠嗅上皮的显微照片，用MmPeriC1抗Pcnt抗血清（A和A'，绿色）和Cen3抗体（B和B'，红色）双重标记，作为睫状体的标记。（A） Pcnt定位于嗅觉受体神经元的睫状体区域和小鼠嗅觉上皮其他细胞的中心体。（A'）高倍镜显示，受体神经元嗅球内的Pcnt呈点状染色。（B） Cen3和Pcnt一样，定位于嗅觉受体神经元的睫状体区域和小鼠嗅觉上皮其他细胞的中心体。（B’）高倍镜显示Cen3优先定位于受体神经元嗅球的睫状体表面。（C） Pcnt（绿色）和Cen3（红色）染色合并DAPI核染色（蓝色）。（C’）合并信号的放大倍数越高，显示Pcnt和Cen3在受体神经元嗅球的睫状体部分共定位。（D） 嗅觉受体神经元示意图及其嗅球高倍视图，Pcnt（绿色）位于基底体复合体（BBC），Cen3（红色）位于嗅纤毛（OC）BBC的过渡区（TZ）。（E–G）成年小鼠嗅上皮切片的显微照片，Pcnt（E，绿色）和ac.tubulin（F，红色）双重标记，作为嗅纤毛轴丝的标记。（E） Pcnt定位于嗅觉受体神经元的纤毛区和小鼠嗅觉上皮中其他细胞的中心体。（F） Ac.微管蛋白与Pcnt一样，定位于嗅觉受体神经元的睫状体区域。（G） 染色与DAPI核染色（蓝色）相结合，显示Pcnt和ac.微管蛋白在嗅觉受体神经元的睫状区部分共定位。C： 中心粒；BB：基体。比例尺：20微米（C G），5微米（C’）。
图4
图4。小鼠视网膜中连接纤毛和中心体的中心蛋白定位。
（A–D）垂直冷冻切片通过成年小鼠视网膜的显微照片，Pcnt（A，绿色）和Cen3（B，红色）双重标记。（C，D）如染色与用DAPI额外标记细胞核所见，Pcnt和Cen3共同定位于感光细胞的睫状体区域和其他视网膜细胞的中心体。（E） MmPeriC1抗血清及其抗原肽的预吸附控制导致缺乏Pcnt标记。（F–M）Pcnt（F，J，绿色）和Cen3（G，K，红色）在连接纤毛的感光细胞（F–H）的BBC和INL（J–L）中非感光细胞的中心体的亚细胞定位。（H’）英国广播公司（BBC）的更高权力观点显示了Pcnt和Cen3的部分共同定位。（五十） 在非光受体细胞中，Pcnt和Cen3共同定位于中心体的中心粒。（I，M）方案总结了Pcnt和Cen3在感光细胞连接纤毛（I）和非感光细胞中心体（M）的亚细胞定位。OS：外段；IS：内段；ONL：外核层；OPL：外丛状层；INL：内部核层；IPL：内网状层；GCL：神经节细胞层；BB：基体；C： 中心粒；CC：连接纤毛；CP：萼突；MTs：微管；N： 核心。比例尺：20微米（D，F）、2微米（I）、1微米（I’）和2微米（m）。
图5
图5。小鼠光感受器中Pericentrin的免疫电镜定位。
（A） 感光器光敏外段（OS）尖端被视网膜色素上皮（RPE）包围的小鼠视杆感光器示意图。（B） 睫状体结构图。光敏OS通过纤毛（CC）与代谢内段（is）相连，代谢内段包括其顶端的基底体复合体（BBC）。（C–H）电子显微照片显示Pcnt在光感受器睫状区的超微结构定位。通过睫状体区域的纵切面（C，D，G，H）和横切面（E，F）显示Pcnt存在于基底体（BB）（C，D，G），但不存在于CC（F，H）的其他部位。在IS的顶端区域，Pcnt位于BBC（E）的中心粒（C）（F，G，H），但不位于萼突（CP）的细胞质（C，D，H）。N： 细胞核；CR：纤毛小根。比例尺：0.5µm（B、C、D、H），0.2µm（E、F、G）。
图6
图6。小鼠光感受器基底体复合体中各种中心蛋白相互作用伙伴的染色。
（A） 脊椎动物视杆感光器的示意图。（B–F）通过成年小鼠视网膜的垂直冷冻切片的显微照片，以CG-NAP（B，绿色）和Cen3（C，红色）双重标记作为睫状体（连接纤毛（CC）和基底复合体（BBC））和中心体的标记。（B） CG-NAP和（C）Cen3定位于感光细胞的睫状体区域和其他视网膜细胞的中心体。（D） 染色与附加的DAPI核染色（蓝色）合并显示CG-NAP和Cen3在感光细胞的睫状体区域和其他视网膜细胞的中心体部分共定位。（E–F）高倍镜显示CG-NAP在连接纤毛的BBC（E）和其他视网膜细胞的中心体（F）的定位。（G） 睫状体结构图。（H–K）高倍视图显示了Pcnt相互作用伙伴PCM1（H，绿色）、DISC1（I，绿色）、IFT20（J，绿色）和PC2（K，绿色）在光感受器连接纤毛的BBC处的定位。Cen3（红色）用睫状体标记整个纤毛。RPE：视网膜色素上皮；OS：外段；IS：内段；ONL：外核层；OPL：外丛状层；BB：基体；CC：连接纤毛；C： 中心粒；CP：萼突；MTs：微管；N： 细胞核；S： 突触。比例尺：10微米（B），1微米（E，F，J，K，H，I）。
图7
图7。不同小鼠组织中Pericentrin剪接变异体的表达。
（A） 以Pcnt S、Pcnt B和β-actin的特异引物集作为阳性对照，用视网膜、嗅上皮（嗅上皮）和NIH 3T3小鼠成纤维细胞的cDNA进行RT-PCR。所有三组引物和使用的试剂均由不含cDNA的阴性对照（对照）进行测试。Pcnt S在视网膜和NIH 3T3小鼠成纤维细胞中表达，但在嗅觉上皮中不表达。Pcnt B在所有三个测试探针中表示。β-肌动蛋白阳性对照显示所用cDNA的大致数量和质量。（B） 使用MmPeriC1抗血清对视网膜、嗅上皮和NIH 3T3小鼠成纤维细胞的蛋白质提取物进行Western blot分析。在所有三个样品中都检测到360kDa的蛋白带。分子量不同的第二条蛋白带（嗅上皮和NIH 3T3小鼠成纤维细胞中约250 kDa，视网膜中约225 kDa）表明不同组织中存在不同的Pcnt变体。（C） 将MmPeric1抗血清与饱和浓度的相应抗原进行预吸附控制，会阻止检测所有三个组织样本中的蛋白带。
图8
图8。分离的小鼠光感受器中Pericentrin剪接变异体的表达。
（A–D）激光显微切割分离感光细胞层或残余视网膜层部分的方法说明。（E） 以Pcnt S、Pcnt B和β-actin的特异性引物集作为阳性对照，用光感受器细胞层（PhRL）解剖部分和视网膜其余解剖部分（其余视网膜）的cDNA进行RT-PCR。所有三组引物和使用的试剂均由不含cDNA的阴性对照（对照）进行测试。Pcnt S在PhRL和视网膜的其余部分中表达，但PhRL中的信号略强于视网膜的其余部分。Pcnt B在PhRL和视网膜其他部位表达，但PhRL中的信号略弱于视网膜其他部位。β-肌动蛋白阳性对照显示所用cDNA的大致数量和质量。（F） 在PhRL解剖部分提取物的Western blot分析中，检测到两条分子量约为360kDa和225kDa的特异性条带。这两条带代表光感受器的两个Pcnt剪接变体。较小的225 kDa Pcnt形式（很可能是Pcnt S的变体）比较大的Pcnt B 360 kDa形式表达更强。
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