跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2011年12月；7(12):1423-33.
doi:10.4161/auto.7.12.18027。

Atg13和FIP200在自噬诱导中独立于Ulk1和Ulk2

塞巴斯蒂安·阿列尔斯 1, 安捷·Söffler, 弗洛里安·帕什, 亚历山德拉·M·迪特勒, Hildegard Keppeler公司, Kirsten Lauber公司, 大卫·G·坎贝尔, 比吉特·费伦巴赫, 马丁·沙勒, 塞巴斯蒂安·韦塞尔堡, 比约恩鹳
附属公司

Atg13和FIP200在自噬诱导中独立于Ulk1和Ulk2

塞巴斯蒂安·阿列尔斯等。 自噬. 2011年12月.

摘要

在正常生长条件下，哺乳动物雷帕霉素复合物1靶点（mTORC1）负性调节由Unc-51样激酶1/2（Ulk1/2）、200 kDa的黏着斑激酶家族相互作用蛋白（FIP200）和Atg13组成的中央自噬调节复合物。饥饿时，mTORC1介导的对该复合物的抑制被释放，从而导致Ulk1/2激活。在这种情况下，Atg13被认为是介导Ulk1/2和FIP200之间相互作用并增强Ulk1/2激酶活性的适配器。利用Atg13缺陷细胞，我们证明Atg13对自噬诱导是必不可少的。我们进一步表明，Atg13函数严格依赖于FIP200绑定。相反，同时敲除Ulk1和Ulk2对自噬诱导没有类似的作用。因此，我们在Atg13中确定的Ulk1依赖性磷酸化位点在这个过程中是可消耗的。这表明Atg13具有独立于Ulk1/2的额外功能，并且Atg13和FIP200在自噬诱导过程中协同作用。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
生成Atg13缺陷的DT40细胞。（A） Atg13缺陷型DT40 B细胞系(第13天−/−)都是由两者的定向破坏产生的第13天等位基因。使用野生型、hisD-或bsr-靶向等位基因特异性引物的基因组PCR证实了靶向成功（详见图S1）。来自任意一种野生型（wt）细胞的清除细胞裂解物的等量蛋白质（第1道），第13天+/−克隆（车道2–3）和第13天−/−通过免疫印迹法分析克隆（4–7道）的Atg13和GAPDH。星号表示未指定的背景带。（B） 野生型和第13页−/−用10 nM巴非霉素A处理逆转录病毒转染了编码mCitrine-LC3B的cDNA的DT40细胞1（BafA1）或DMSO（对照）6小时，并通过共焦激光扫描显微镜直接观察（棒材：10µm）。（C） 对（B）中描述的细胞的清除细胞裂解物进行抗Atg13和抗LC3免疫印迹。LC3-II/LC3-I比率表示为三个独立实验的平均值±SEM（D）第13天−/−用HA标记的全长鸡Atg13亚型A（9–12道）重组的细胞在正常生长培养基（RPMI）或饥饿培养基（EBSS）中培养1h，有或无10nM（BafA1）。通过免疫印迹法分析清除的细胞裂解液中的等蛋白量的Atg13、GAPDH和LC3。作为对照，野生型细胞（1-4车道）和第13页−/−用空载体（5-8道）重组的细胞进行平行分析。LC3-II/GAPDH比值表示为三个独立实验±SEM的平均值。
图2。
图2。
Atg13对自噬体的生成至关重要（A）DT40野生型和（B）第13天−/−细胞在正常生长培养基（对照）或EBSS中孵育2小时。细胞固定并通过透射电子显微镜进行分析。每个条件下的代表性单元格以两种不同的放大倍数显示。放大后的图像中，自噬体用黑色箭头表示，线粒体肿胀用星号表示（条形：500 nm）。（C） 野生型和（D）第13天−/−用编码mRFP-EGFP-rLC3的cDNA逆转录转染的细胞在EBSS中孵育2h，并用激光共聚焦扫描显微镜进行分析。在合并图像中，mRFP信号显示为红色，EGFP信号显示为绿色。自体溶酶体用白色箭头表示（条：10µm）。含有自体溶酶体的细胞百分比（>200个细胞/实验）表示为两个独立实验的平均值±范围。
图3。
图3。
Ulk1和Ulk2对于DT40细胞的自噬诱导是不可或缺的。（A） Ulk1缺失的DT40细胞(ulk1号机组−/−)，Ulk2(ulk2型−/−)或Ulk1和Ulk2(ulk1/2−/−)通过基因靶向产生，野生型等位基因的丢失通过基因组PCR得到确认（详情见图S2）。缺少ulk1号机组和ulk2号机组转录本经RT-PCR验证。（B） 野生型细胞和两个独立的双缺陷细胞ulk1/2−/−克隆（2-6和17-16）在全培养基（RPMI）或EBSS中，在存在或不存在10nM BafA1的情况下孵育1小时。通过免疫印迹分析来自清除的细胞裂解物的等量蛋白质的Atg13、GAPDH和LC3。LC3-II/GAPDH比值表示为三个独立实验的平均值±SEM（C）ulk1/2−/−细胞（克隆2-6）在正常生长培养基（对照）或EBSS中孵育2h，固定细胞并进行透射电镜分析。对于饥饿状态，代表性的细胞以两种不同的放大倍数显示。在放大倍率较高的图像中，自噬体由黑色箭头指示（条形：500 nm）。（D）单位1/2−/−用编码mRFP-EGFP-rLC3的cDNA逆转录转染的细胞（克隆2-6）在EBSS中孵育2h，并用共焦激光扫描显微镜进行分析。在合并图像中，mRFP信号显示为红色，EGFP信号显示为绿色。自体溶酶体用白色箭头表示（条：10µm）。带有自溶体的细胞百分比（>100个细胞/实验）表示为三个独立实验的平均值±SD。n.s.表示野生型和ulk1/2−/−细胞（学生t检验）。
图4。
图4。
Atg13中的FIP200结合位点由外显子12编码。（A） 从DT40细胞扩增的Atg13剪接变异体（命名为A-G）的示意图。（B） 使用剪接变异体特异性引物组合通过qRT-PCR分析这些剪接变种的相对丰度（参见补充材料和方法图S8A）。（C）第13天−/−用HA标记的剪接变异体A-G重组细胞，裂解产物进行抗HA免疫沉淀，并通过免疫印迹分析Atg13和FIP200。星号表示不特定的背景带。
图5。
图5。
FIP200结合位点对Atg13功能至关重要。（A）第13天−/−用HA标记的剪接变异体A-G重组细胞，并在有或无10 nM BafA1的全培养基（RPMI）或EBSS中培养1小时。通过免疫印迹法分析清除的细胞裂解液中的等蛋白量的Atg13、HSP90和LC3。来自三个独立实验的LC3-II/HSP90比率表示为平均值±SEM（B）第13页−/−用编码HA-Atg13亚型A（全长）或HA-Atg13-亚型C（？外显子12）的cDNA逆转录病毒转染或用pmRFP-EGFP-rLC3稳定转染空载体。细胞在EBSS中孵育2 h，并通过共焦激光扫描显微镜进行分析。在合并图像中，mRFP信号显示为红色，EGFP信号显示为绿色。三个独立实验中含有自体溶酶体的细胞百分比（>100个细胞/实验）表示为平均值±SD*p<0.05，Student t检验。
图6。
图6。
不同Atg13依赖性自噬诱导途径的模型。根据先前的研究结果，有人提出mTORC1在富含营养的条件下与Ulk-Atg13-FIP200复合物结合，在抑制位点磷酸化Ulk1/2和Atg13，并抑制Ulk1/2激酶活性。饥饿或直接mTORC1抑制后，这种负调控被释放，Ulk1/2在激活位点自我磷酸化，随后磷酸化Atg13和FIP200。这反过来导致自噬诱导（mTORC1-Ulk1/2轴）。在通过自噬诱导对mTORC1抑制反应并依赖于Ulk1和Ulk2的细胞中，此途径最有可能受到青睐。然而第13天−/−和ulk1/2−/−DT40细胞让我们假设Atg13具有更基本的功能，不一定受Ulk1或Ulk2调节，但一定需要FIP200结合能力。因此，令人惊讶的是，Atg13除了作为连接Ulk1/2及其底物FIP200的适配器分子的拟议功能外，还有一个额外的作用。可以想象有几种作用模式：（A）Atg13以激酶依赖的方式发挥作用，例如通过稳定或招募FIP200，（B）Atg13-FIP200复合物以激酶依赖方式调节，或（C）Atg17-FIP200由Ulk1/2以外的其他激酶调节。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

  • 哺乳动物ULK1复合体和自噬起始。
    Zachari M，Ganley IG。 Zachari M等人。 生物化学论文。2017年12月12日；61(6):585-596. doi:10.1042/EBC20170021。2017年12月12日印刷。 生物化学论文。2017 PMID：29233870 免费PMC文章。 审查。
  • ATG13：只是自噬程序的同伴，还是执行者？
    Alers S、Wesselborg S、Stork B。 Alers S等人。 自噬。2014年6月；10(6):944-56. doi:10.4161自动.2987。 自噬。2014 PMID：24879146 免费PMC文章。 审查。
  • ULK1.ATG13.FIP200复合物介导mTOR信号，对自噬至关重要。
    Ganley IG、Lam du H、Wang J、Ding X、Chen S、Jiang X。 Ganley IG等人。 生物化学杂志。2009年5月1日；284(18):12297-305. doi:10.1074/jbc。M900573200.Epub 2009年3月3日。 生物化学杂志。2009 PMID：19258318 免费PMC文章。
  • ULK-Atg13-FIP200复合物介导mTOR信号传导至自噬机制。
    Jung CH、Jun CB、Ro SH、Kim YM、Otto NM、Cao J、Kundu M、Kim DH。 Jung CH等人。 分子生物学细胞。2009年4月；20(7):1992-2003. doi:10.1091/mbc.e08-12-1249。Epub 2009年2月18日。 分子生物学细胞。2009 PMID：19225151 免费PMC文章。
  • 营养依赖性mTORC1与自噬所需的ULK1-Atg13-FIP200复合物的关联。
    细川N、原田T、Kaizuka T、Kishi C、Takamura A、Miura Y、Iemura S、Natsume T、Takehana K、Yamada N、Guan JL、Oshiro N、Mizushima N。 细川N等人。 分子生物学细胞。2009年4月；20(7):1981-91. doi:10.1091/mbc.e08-12-1248。Epub 2009年2月11日。 分子生物学细胞。2009 PMID：19211835 免费PMC文章。
查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Kabeya Y、Kamada Y、Baba M、Takikawa H、Sasaki M、Ohsumi Y。Atg17与Atg1和Atg13在酵母自噬中协同发挥作用。分子生物学细胞。2005;16:2544–53. doi:10.1091/mbc。E04-08-0669。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Kamada Y、Funakoshi T、Shintani T、Nagano K、Ohsumi M、Ohsimi Y。通过Apg1蛋白激酶复合物介导自噬诱导。细胞生物学杂志。2000年；150:1507–13. doi:10.1083/jcb.150.6.1507。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Chan EY，Kir S，Tooze SA。对激肽组进行siRNA筛选，确定ULK1是自噬的多域调节剂。生物化学杂志。2007;282:25464–74. doi:10.1074/jbc。M703663200。-DOI程序-公共医学
    1. Kuroyanagi H、Yan J、Seki N、Yamanouchi Y、Suzuki Y、Takano T等。人类ULK1，一种与秀丽隐杆线虫UNC-51激酶相关的新型丝氨酸/苏氨酸激酶：cDNA克隆、表达和染色体分配。基因组学。1998;51:76–85. doi:10.1006/geno.1998.5340。-DOI程序-公共医学
    1. Tomoda T、Bhatt RS、Kuroyanagi H、Shirasawa T、Hatten ME。一种与秀丽线虫UNC51同源的小鼠丝氨酸/苏氨酸激酶在小脑颗粒神经元的平行纤维形成中发挥作用。神经元。1999;24:833–46. doi:10.1016/S0896-6273（00）81031-4。-DOI程序-公共医学

出版物类型

物质

赠款和资金