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.2012年1月；20(1):101-8.
doi:10.1038/mt.2011.22。 Epub 2011年10月11日。

短干扰RNA通过TLR3和IRF3诱导视网膜变性

马克·克莱曼 1, Hiroki Kaneko先生, 赢得Gil Cho, 萨米·德里迪, 本杰明·福勒, 亚历山大·布兰德福德, 罗穆洛J C阿尔伯克基, 平野义雄, Hiroko Terasaki先生, 近藤敏欧, 藤田隆志, 巴拉默里·K·安巴蒂, 瓦莱里娅·塔拉洛, 布拉德利·D·盖尔芬德, 萨沙·博格达诺维奇, 朱迪特·兹·巴菲, 贾亚克里什纳·安巴蒂
附属公司

短干扰RNA通过TLR3和IRF3诱导视网膜变性

马克·克莱曼等。 分子治疗. 2012年1月.

摘要

内源性双链RNA（dsRNA）导致序列特异性基因沉默的发现，将合成的短干扰RNA（siRNAs）推向了靶向药物工程的前沿。首次临床试验使用21-核苷酸（nt）siRNA治疗新生血管年龄相关性黄斑变性（AMD）。令人惊讶的是，这些化合物并不是为细胞渗透而配制的，而细胞渗透是真正的RNA干扰（RNAi）所必需的。我们发现，这些“裸”siRNAs不是通过RNAi，而是通过细胞表面Toll-like受体-3（TLR3）的序列诱导激活来抑制小鼠的新生血管。在这里，我们证明非内化siRNA通过激活视网膜色素上皮细胞表面TLR3诱导小鼠视网膜变性。能够通过细胞渗透和触发RNAi的胆固醇结合siRNAs也诱导相同的表型。用短于21-nts的siRNAs治疗后未观察到视网膜变性。其他细胞溶质dsRNA传感器对这种反应并不重要。TLR3激活通过干扰素调节因子-3的核移位触发caspase-3介导的视网膜色素上皮（RPE）凋亡死亡。虽然siRNAs这种意料之外的副作用对未来的临床试验有影响，但这些发现也引入了一种新的临床前地理萎缩模型（GA），这是一种导致全世界数百万人失明的干型AMD晚期。

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数字

图1
图1
21-核苷酸（nt）短干扰RNA（siRNAs）诱导视网膜变性。(一)玻璃体内磷酸盐缓冲盐水（PBS）对照组和(b条)21吨-吕克-siRNA显示大的色素沉着区，表明视网膜色素上皮（RPE）丢失（黑色箭头，n个=四个独立实验中每组24个，P（P）通过Fisher精确检验<0.0001）。(c（c）)16-nt的管理-吕克-siRNA未诱导视网膜变性(n个=24，在四个独立实验中，P（P）< 0.0001). (d日)体内光学相干断层扫描视网膜成像显示外视网膜和RPE（用红色括号括起来）有明显破裂，21-nt吕克小核糖核酸(n个=6，在两个独立实验中）。16-nt后1周RPE平片闭塞带-1（ZO-1）免疫荧光（红色）-吕克-小干扰RNA(e（电子）)显示均匀排列的六边形细胞，但21-nt-吕克-siRNA处理(（f）)导致这种结合模式的显著破坏，细胞形态发生巨大变化(n个=4，在两个独立实验中）。棒材（d）=200µm；棒材（e，f）=20µm。
图2
图2
显微镜特征 21-核苷酸（nt）短干扰RNA（siRNAs）诱导视网膜变性。治疗后1周的组织形态学评估(n个=6–8（在两个独立实验中）表明(一)16吨-吕克-siRNA没有改变正常的RPE细胞单层，而(b条)21吨-吕克-siRNA导致显著的视网膜和RPE变性，并伴有严重的色素丢失和空泡化（红色括号）。此时点的超微结构检查(n个在两个独立的实验中为4–6），在磷酸盐缓冲盐水（PBS）和16-nt中显示出有序的感光细胞阵列和融合的RPE-吕克-小干扰RNA(c（c）,d日)但RPE明显改变，伴有21-nt的大空泡（星号）-吕克-小干扰RNA(e（电子）). 棒材（a–b）=20µm；（c–e），2µm。INL，内核层；ONL，外核层；POS、感光细胞外段、RPE、视网膜色素上皮。
图3
图3
玻璃体内21-核苷酸（nt）-短干扰RNA 给药抑制视网膜功能显示了小鼠暗视闪光视网膜电图（ERG）期间的典型波形和振幅响应。每周玻璃体内注射21-nt-吕克-与磷酸盐缓冲盐水（PBS）对照组相比，共三次注射siRNA后，a波和b波振幅响应分别显著降低15.8±0.87%和13.2±0.39%(n个=在两个独立实验中每组8个*P（P）<0.05，曼·惠特尼U型测试）。
图4
图4
短链和长链双链RNA（dsRNA）诱导的视网膜变性需要Toll样受体-3（TLR3）。(一)一张典型的彩色眼底照片显示玻璃体内联合注射21-nt后视网膜变性-吕克-siRNA和同种免疫球蛋白G（IgG）(n个=6，在两个独立实验中）。(b条,c（c）)21吨-吕克-用中和TLR3抗体对眼睛进行预处理时，不会发生siRNA诱导的视网膜毒性(n个=两个独立实验中为6）或TLR3表达不足的小鼠(第三阶段–/–,n个=12，在三个独立实验中）。(d日)小鼠眼睛的TLR3免疫荧光显示出与视网膜色素上皮（RPE）标记物RPE65的强信号共定位(n个在三个独立实验中=3，Bar=10µm）。小鼠RPE（mRPE）细胞表面和细胞内TLR3染色的代表性直方图(e（电子）)和人类RPE（hRPE）(（f）)单元格(n个=4–5（在两个独立实验中）。nt，核苷酸。
图5
图5
21核苷酸（nt）短干扰RNA（siRNA）结合并激活在视网膜色素上皮（RPE）细胞表面表达的Toll样受体-3（TLR3）。(一)生物素化21-nt亲和素免疫沉淀证实了物理结合吕克siRNA，其显示＞250 kDa的TLR3免疫反应带，通过竞争测定减少(n个=3，在三个独立实验中）。(b条)暴露于21-nt后5分钟，在原代hRPE细胞中检测到TLR3磷酸化-吕克-小干扰RNA(n个=3，在三个独立实验中）。GAPDH用作装载控制。
图6
图6
21-核苷酸（nt）短干扰RNA（siRNA）降低视网膜色素上皮（RPE）活性并增加细胞凋亡。(一)聚I:C（pIC）和21-nt-吕克-用BrdU掺入法测定siRNA显著降低hRPE细胞增殖(n个=3，在三个独立实验中）。(b条,c（c）)TUNEL染色发现21-nt组视网膜和RPE层晚期凋亡细胞数量显著增加-吕克-siRNA与16-nt的比较-吕克-24小时siRNA(n个=在两个独立实验中为6，分别为13.68±0.89%和3.70±0.25%，P（P）<0.01，曼·惠特尼U型-测试）。TUNEL+细胞核更集中于ONL/RPE（星号）的波状改变区域**P（P）<0.01和*P（P）<0.05，作者：Mann–WhitneyU型-测试。棒材代表平均值±SEM。棒材=20µm。
图7
图7
21-核苷酸（nt）短干扰RNA（siRNA）诱导的Toll样受体-3（TLR3）信号传导激活视网膜色素上皮（RPE）中的caspase-3。(一)21-nt治疗后，通过荧光分析法定量小鼠RPE/脉络膜和hRPE细胞中活性裂解caspase-3-吕克-siRNA和poly I:C（pIC）与磷酸盐缓冲盐水（PBS）对照的比较(n个=6，在两个独立实验中，折叠调节分别为1.56±0.11和2.05±0.39）。(b条–d日)21-nt后24小时白化Balb/C小鼠眼活性裂解caspase-3的免疫检测-吕克-siRNA或pIC在RPE细胞（黑色箭头）中显示信号增强，在神经视网膜层中显示可变染色(n个在三个独立实验中=3，Bar=20µm）*P（P）<0.05，作者：Mann–WhitneyU型-测试。条形代表平均值±SEM。siRNA，短干扰RNA。
图8
图8
Toll样受体-3（TLR3）通过IRF3介导视网膜色素上皮（RPE）细胞死亡信号。(一–c（c）)红外线3–/–21-nt对小鼠的眼底无影响-吕克-小干扰RNA(d日)用21-nt处理1小时后，hRPE细胞胞质和核组分的IRF3免疫印迹显示核信号增强-吕克-小干扰RNA(n个=3，在三个独立实验中）。内务蛋白GAPDH和核仁素分别作为细胞质和核组分的负荷控制。nt，核苷酸。siRNA，短干扰RNA。
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