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.2011年10月；23(10):3761-79.
doi:10.1105/tpc.111.090993。 Epub 2011年10月7日。

ATG1/ATG13蛋白激酶复合物是拟南芥自噬循环的调节器和靶点

Anongpat Suttangkakul公司 1, 李发强, 大戎钟, 理查德·德维斯特拉
附属公司

ATG1/ATG13蛋白激酶复合物是拟南芥自噬循环的调节器和靶点

Anongpat Suttangkakul公司等。 植物细胞. 2011年10月.

勘误表in

摘要

自噬是真核生物的一种细胞内循环途径，细胞器和细胞质被隔离在囊泡中，随后被输送到液泡中进行分解。该过程是由聚集在自噬相关1（ATG1）/ATG13激酶复合物上的各种营养反应性信号级联诱导的。在这里，我们描述了拟南芥中的ATG1/13复合物，并表明它既是一个调节器，也是一个自噬靶点。缺失ATG13的植物对营养限制和过早衰老极为敏感，类似于缺乏ATG系统其他成分的突变体。ATG12-ATG5和ATG8-磷脂酰乙醇胺加合物的合成对自噬至关重要，但在ATG13缺乏的植物中仍然存在，但ATG8降解的自噬体的生物发生却没有，这表明该复合物调节自噬小体封闭和/或空泡传递所需的下游事件。令人惊讶的是，ATG1a和ATG13a磷酸蛋白的水平在营养素饥饿期间急剧下降，而在添加营养素后再次上升。这种转换被ATG系统的抑制所抵消，表明ATG1/13复合物成为自噬的靶点。与此机制一致，ATG1a与ATG8-脱乙酰的自噬体一起传递到液泡。鉴于其对营养需求的反应，ATG1/13激酶的周转可能提供了一种动态机制，将自噬与植物的营养状态紧密联系起来。

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数字

图1。
图1。
的结构和遗传分析拟南芥ATG1和ATG13公司基因家族。（A）的基因图自动液位计1基因家族。白色和阴影框分别表示UTR和编码区域。黑盒标识N末端激酶和C末端调节域。箭头表示激酶结构域中的催化位点Lys（K）和ATP结合位点。线表示内含子。三角形标记T-DNA插入位点，并用等位基因名称标记。用于RT-PCR的引物的位置由箭头确定。aa，氨基酸。（B）比较ATG1a公司和ATG1t型转录结构。的编码区域ATG1t型直接终止于激酶结构域（黑盒）的远端，随后是编码DNA聚合酶Bδ亚基（交叉阴影盒）的部分转录本。Y定位δ亚基活性所需的催化Tyr。氨基酸。（C）的核苷酸和衍生氨基酸序列ATG1t型连接点周围的基因ATG1t型一部分DNA聚合酶Bδ编码序列的转录本。星号表示终止密码子。（D）基因图ATG13公司基因家族。白色和阴影框分别表示UTR和编码区域。线表示内含子。三角形标记T-DNA插入位点，并用等位基因名称标记。用于RT-PCR的引物的位置由箭头确定。氨基酸。（E）RT-PCR分析atg1a,atg13a、和atg13bT-DNA插入突变体。使用所示的引物对野生型或纯合突变植物的总RNA进行RT-PCR（A）和（D）.RT-PCR与第2页-使用特异性引物来确认等量RNA的分析。
图2。
图2。
ATG1a和ATG13a与自噬室相互作用和关联。（A）ATG1-ATG13相互作用的Y2H分析。在酵母中，在含有3-氨基-1,2,4-三唑且缺乏Trp、Leu和His的选择培养基上，以与GAL4 DNA激活物（AD）或结合域（BD）的N末端融合的形式表达的全长ATG1a和ATG13a在酵母中共表达。ATG7和ATG8a之间的已知相互作用作为阳性对照。AD和BD表示AD和BD-质粒为空。（B）ATG1a和ATG13a在自噬型细胞中的定位拟南芥原生质体。融合到ATG8a、ATG1a或ATG13a的游离GFP和GFP在叶片原生质体中瞬时表达，并在转化后18 h通过荧光共聚焦显微镜观察其定位。绿色，GFP荧光；红色，叶绿素荧光。箭头定位细胞质中可能的自噬体。星号标记液泡内潜在的自噬体。（C）ATG1a和ATG13a的BiFC分析拟南芥在转化后18 h，用荧光共聚焦显微镜在叶片原生质体中检测到分离的nYFP和cYFP报告子同时单独表达或融合到ATG1a和ATG13a的N末端。显示了从YFP和叶绿素（氯）荧光和明场（BF）显微镜获得的图像。棒材=5μm。
图3。
图3。
ATG1和ATG13的表达模式。（A）成绩单丰度模式自动液位计1和ATG13公司从Genevestigator数据库获得的家族(https://www.genefestigator.ethz.ch/). 每个位点的EST编号列在底部。（B）各种提取物中ATG1a和ATG13a蛋白的免疫印迹检测拟南芥从土生植物上切下的组织。用抗PBA1抗体进行免疫印迹分析以评估蛋白质负载。ATG1a和各种ATG13a物种的迁移位置，由其在atg1a-1和atg13a-1 atg13b-2指示植物。星号表示一种与抗ATG1a抗体无特定交叉反应的蛋白质。玫瑰，玫瑰花结；森，衰老；Yg，年轻。
图4。
图4。
在13a到13b植物表现出自噬突变体的表型特征。测试的品系包括野生型（WT）Col-0，纯合第5-1页,atg7-2,atg13a-1,atg13a-2,atg13b-1,atg13b-2单个突变体，以及atg13a-1 atg13b-2和atg13a-2 atg13b-2双突变体（A）对氮饥饿的敏感性。幼苗在MS+N液体培养基上生长1周，然后转移到富氮（+N）或缺氮（-N）培养基上再培养2周。（B）加速衰老。植物在22°C的土壤中以SD光周期生长10周。（C）对固定C饥饿的敏感性。植物在LD下在不添加Suc的含MS琼脂上生长2周，转入黑暗中10或13天，然后在LD中恢复12天。（D）固定C饥饿后的植物存活率（C）每一条代表平均存活率（±标准偏差)在三个重复中，每个重复至少检查15个幼苗。
图5。
图5。
atg13a atg13b突变体可以生成ATG12-ATG5和ATG8-PE加合物，但不能生成自噬体（A）用免疫印迹法检测ATG1a、ATG13a、ATG8、ATG5和ATG12-ATG5结合物在单、双纯合苗中的突变ATG1a公司,自动液位计5,自动液位计7,ATG13a型、和ATG13b。箭头定位ATG1a、ATG5和ATG12-ATG5共轭。显示了各种形式的ATG13a的表观分子质量。星号识别和抗ATG1a或ATG13a抗体无特定交叉反应的蛋白质。用抗PBA1抗体进行免疫印迹分析，以确认蛋白质载量相等。WT，野生型。（B）膜组分中ATG8-PE加合物的免疫印迹检测。CE，分馏前的粗幼苗提取物；S、 离心后获得的可溶性级分；Mem，离心后获得并在Triton X-100中溶解的膜部分。在6 M尿素中进行SDS-PAGE之前，在37°C下用PLD处理组分1小时。虚线，自由ATG8；实线，ATG8-PE加合物。（C）检测GFP-ATG8a空泡破裂产生的游离GFP。在提取之前，将表达GFP-ATG8a的7天龄突变体和野生型幼苗暴露于缺氮培养基中指定的时间。粗提物经SDS-PAGE和抗GFP抗体免疫印迹分析。GFP-ATG8a和自由GFP分别由闭合箭头和开放箭头定位。使用抗-PBA1抗体来确认蛋白质负载量相等。（D） atg13a atg13b突变植物不能产生自噬体。将表达GFP-ATG8a的7天龄突变体和野生型幼苗暴露于含或不含CA的缺氮培养基中16 h，然后通过荧光共聚焦显微镜观察。Bar=10μm[有关此图的彩色版本，请参阅在线文章。]
图6。
图6。
在固定C/N限制期间，ATG1a和ATG13a蛋白而非转录水平消失。将5天龄的野生型幼苗保存在富含C/N（+Suc+N）的固定培养基中，或在连续光照下切换到C/N限制性固定培养基（−Suc−N）中，然后在提取总蛋白和RNA之前培养1 d。（A）通过免疫印迹分析检测ATG1a和ATG13a蛋白水平。使用抗-PBA1抗体来确认蛋白质负载量相等。显示了ATG1a和三种ATG13a亚型的表观分子量。（B） ATG1a公司和ATG13a公司RT-PCR检测的mRNA水平。RT-PCR与UBC21型-用特异性引物对等量的总RNA进行分析。
图7。
图7。
ATG1a和ATG13a蛋白在固定C/N限制期间迅速消失。在提取总蛋白之前，将生长在LD中的五日龄野生型幼苗保存在+Suc+N培养基中，或切换到+Suc−N、−Suc+N或−Suc−的N培养基，持续指定的时间。（A）和（C）抗ATG1a抗体对饥饿时间进程的免疫印迹分析（A）和ATG13a抗体（C）.每条车道包含等量的纸巾新鲜重量。用抗PBA1抗体进行免疫印迹分析，以确认蛋白质负荷接近相等。（B）和（D）ATG1a定量（B）和ATG13a（D）使用PBA1信号归一化消失。
图8。
图8。
ATG1a和ATG13a蛋白质在Suc/N限制的植物被引用后迅速重新出现。在提取总蛋白之前，将5天龄的野生型幼苗保存在+Suc+N培养基中或切换至−Suc−N培养基36小时，然后再切换至+Suc+N培养基指定的时间。（A）用抗ATG1a或ATG13a抗体对再喂养时间过程进行免疫印迹分析。每条车道包含等量的纸巾新鲜重量。用抗PBA1抗体进行免疫印迹分析，以确认蛋白质负荷接近相等。（B）和（C）ATG1a定量（B）和ATG13a（C）使用来自PBA1的信号归一化再现。
图9。
图9。
ATG1a和ATG13a蛋白质的周转和磷酸化状态受自噬调节。（A）到（C）抑制剂和突变体对饥饿期间ATG1a和ATG13a周转的影响。不同遗传背景的五日龄幼苗要么保存在+Suc+N培养基（+）中，要么在+Suc-N培养基（-）中吨=0，然后在提取总蛋白之前培养指定时间。用抗ATG1a和ATG13a抗体进行免疫印迹分析，检测ATG1a及ATG13a-蛋白水平。用抗PBA1抗体进行免疫印迹分析，以确认蛋白质负荷接近相等。每条车道包含等量的纸巾新鲜重量。（A）各种抑制剂的作用。CA（0.5μM）、MG132（50μM）或等效体积的二甲基亚砜在吨= 0.（B）各种突变的影响。WT，野生型。（C）固定C/N限制改变了ATG1a的SDS-PAGE迁移率。在限制−Suc−N 72小时之前和之后，在相邻车道或混合（混合）中电泳植物提取物。指出了这两种ATG1a的表观分子质量。（D）λ蛋白磷酸酶对ATG1a和ATG13a的SDS-PAGE迁移率的影响。为了分析ATG1a，第5-1页植物在–Suc−N培养基中培养72小时。为了分析ATG13a，野生型植物生长在+Suc+N培养基中。用含或不含磷酸酶抑制剂PhosSTOP的λ磷酸酶（Ppase）处理提取物1 h，然后用抗ATG1a和抗ATG13a抗体进行免疫印迹分析。联合国，未经处理的提取物。
图10。
图10。
ATG1a在真空中与ATG8a装饰的自噬体联合。（A）氮饥饿诱导的自噬降低了YFP-ATG1a蛋白的水平。野生型（WT）和atg7-2幼苗在富氮琼脂培养基上生长6d，然后转移到不含或含有0.5μM CA（+CA）的富氮（+N）或缺氮（-N）液体培养基上培养16h。用抗ATG1a和抗YFP抗体的免疫印迹法测定YFP-ATG1a蛋白水平。用抗PBA1抗体进行免疫印迹分析，以确认蛋白质载量相等。（B）YFP-ATG1a在需要ATG7的过程中与自噬体相关。七天龄野生型和atg7-2幼苗暴露于含有或不含0.5μM CA的含氮或缺氮液体培养基中。16h后，用荧光共聚焦显微镜对根尖细胞进行成像。棒材=10μm。（C）YFP-ATG1a和mCherry-ATG8a在自噬体中共定位。在+Suc−N培养基上生长表达这两种报告基因的7天龄野生型植物，然后用0.5μM CA处理8小时。通过荧光共焦显微镜对YFP和mCherry的根尖细胞进行成像。合并表示两个图像的叠加。棒材=10μm。液泡腔的放大倍数较高（轮廓由虚线表示），显示两种蛋白质在自噬体上的共定位。棒材=5μm。
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参考文献

    1. Alonso J.M.等人（2003年）。拟南芥全基因组插入突变。科学301:653–657-公共医学
    1. Bassham D.C.（2009年）。植物大自噬的功能和调节。生物化学。生物物理学。1793年学报：1397–1403-公共医学
    1. Behrends C.、Sowa M.E.、Gygi S.P.、Harper J.W.（2010年）。人类自噬系统的网络组织。自然466:68–76-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Chan E.Y.、Longatti A.、McKnight N.C.、Tooze S.A.（2009年）。激酶激活的ULK蛋白通过其保守的C末端结构域使用Atg13非依赖机制抑制自噬。分子细胞。生物学29:157–171-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Chang Y.Y.，Neufeld T.P.（2009）。在TOR介导的自噬调节中具有多重作用的Atg1/Atg13复合物。分子生物学。单元格20:2004–2014-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

MeSH术语